Colesterol

METODOLOGÍA:
Describa los métodos que planea utilizar y fundamente su elección para abordar cada uno de los objetivos del proyecto. (Por ej. Completa descripción del diseño experimental (cuantitativo o cualitativo), elección de tamaños muestrales, uso de bases de datos, archivos, metodología para el análisis estadístico de los resultados (si es pertinente), etc.). La extensión máxima de estasección es de 3 páginas (letra tamaño 10, Arial o Verdana).

Para cumplir con los objetivos plateados en esta investigación se realizaran las siguientes actividades:

I. Elección del material biológico
Se obtendrán muestras de sangre, provenientes de 213 animales, este valor “n” se obtuvo de acuerdo a la formula….cuyo valor se desprende de una estimación de la población de ovejas criollaspresentes en la región, las cuales se cuantifican en unas 36.732 cabezas de ganado ovino, las que representan un 13% de unas 282.557 que simbolizan la población ovina total del sur del país (INE 2007). En este aspecto separaremos nuestro valor “n” en primera instancia de acuerdo al sexo y la raza. 193 hebras de raza Araucana y 10 carneros de la raza Araucana, así como también, 10 carneros de la razaChilota. Las hembras presentan antecedentes de partos múltiples consecutivos de acuerdo a registros reproductivos y los machos provienen de progenitores con características ya mencionadas. Los ovinos de raza Araucana se encuentran disponibles en el Núcleo Genético de ovinos de raza Araucana de la Universidad de La Frontera y de 12 rebaños asociados a este núcleo, los cuales se encuentrandistribuidos en diferentes comunas de la región de la Araucanía (Cunco, Lautaro, Freire, Padre Las Casas, Vilcún, Temuco y Melipeuco). Respecto a los ovinos de raza Chilota, estos se obtendrán del Núcleo Genético de Ovinos de raza Chilota del INIA Butalcura en la localidad de Chiloé y de 10 rebaños que se encuentran distribuidos en diferentes islas del archipiélago.

Las muestras de sangre de losovinos se obtendrán por punción de la vena yugular a través del sistema de extracción de sangre BD Vacutainer® con anticoagulante K2 EDTA a una concentración de 10 mg por tubo de 6 ml. La sangre como muestra biológica, tiene un buen rendimiento, ya que con los 6 ml extraídos, podemos racionar la muestra en alicuotas, para ser utilizada nuevamente, sin necesidad de requerir al animal en reiteradasocasiones y por ende no someterlo a situaciones de estrés que puedan no contribuir a las buenas practicas del bienestar animal, como lo sería la extracción de grandes cantidades de folículo pelicular o muestras de tejido.

II. Extracción de ADN
La extracción de ADN de sangre total se realizará mediante el agente quelante Chelex resin 100 [1], protocolo de extracción de ADN de gran pureza y debajo costo. Brevemente, el protocolo consta de los siguientes pasos: en un tubo eppendorf de 1,5 ml se agrega 1 ml de agua desionizada estéril (ADESI) y 100 ul de sangre total, se homogeniza por inversión la mezcla y se deja reposar por 5 minutos. Centrifugar por 6 minutos el tubo que contiene la sangre y el agua a 5000 rpm. Se elimina el sobrenadante y se agrega nuevamente al tubo 1 ml de ADESI, sehomogeniza la muestra y se centrifuga a 5000 rpm por 5 minutos (repetir este procedimiento hasta que el pellet sea completamente blanco y el sobrenadante cristalino). Se elimina el sobrenadante y se agrega al tubo eppendorf 200 ul de Chelex resin 100 al 5% y 1 ul de proteinasa K a una concentración de 20 mg/ml. Las muestras se dejan incubar en un baño termoregulado a 56ºC por 30 minutos.Terminada la incubación las muestras son sometidas a una denaturación a 95ºC por 8 minutos, posteriormente las muestras son centrifugados a 5000 rpm por 3 minutos. Finalmente se traspasa el sobrenadante a un tubo nuevo, previamente rotulado, y el ADN es almacenado a -20ºC para su posterior uso. Previo a su almacenaje en cada muestra se determinará la concentración y pureza del ADN a través de...