Cromatografia

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Práctica No. 2
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR

FECHA
INTRODUCCION

Uno de los medios más poderosos y útiles para la separación de proteínas y otras macromoléculas, con base a las diferencias en sus tamaños, es la cromatografía de exclusión molecular, conocida también como filtración en gel o cromatografía de tamiz molecular. En este tipo de cromatografía la mezcla deproteínas, disueltas en un tampón apropiado, se deja fluir por gravedad, a lo largo de una columna empaquetada con un material formado de partículas hidratadas de geles muy especiales. Se encuentra en el mercado un buen número de materiales para estos fines, cuya composición y porosidad son controladas cuidadosamente, para lograr que aún moléculas cuyo tamaño es relativamente parecido puedan serseparadas mediante la adecuada selección del gel.

Los geles constan de partículas pequeñas de sustancias hidrofílicas e insolubles, obtenidas al entrecruzar un polisacárido, como el dextrán o la agarosa, con compuestos como el 2,3-dibromopropanol o el N,N'-metilenbisacrilamida, hasta formar una red tridimensional de cadenas polisacáridicas. Las partículas son altamente polares debido alalto contenido de grupos hidroxilo del polisacárido y se hinchan considerablemente cuando se colocan en agua. Las moléculas pequeñas pueden penetrar dentro del gel, pero las grandes son excluidas por la malla entrecruzada del gel. Esto significa que el volumen de solvente accesible es mucho menor para moléculas totalmente excluidas del gel que para moléculas que pueden penetrar libremente en él.En un experimento típico de cromatografía de exclusión molecular, la mezcla de moléculas grandes y pequeñas se coloca sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la mezcla desciende en la columna, las moléculas pequeñas se difunden dentro del gel, teniendo que recorrer un camino más largo, mientras que las moléculas grandes son completamente excluidas de las partículas delgel. Eventualmente se obtiene una separación completa ya que las moléculas grandes salen de la columna primero y por último aparecen las moléculas más pequeñas.

El volumen total de una columna de gel (Vt) es la suma del volumen de la matriz del gel (Vg), el volumen del agua dentro de las partículas del gel (Vi) y el volumen de agua fuera de los granos del gel (Vo):

Vt = Vo + Vi +Vg

Vo se conoce como volumen de exclusión y corresponde a la cantidad de líquido necesaria para eluir compuestos que son completamente excluidos de las partículas del gel. Vi puede calcularse sabiendo el peso del gel seco (a) y el agua necesaria para hidratar el gel (Wr):

Vi = aWr

El volumen de elución (Ve) de un compuesto es el volumen que se necesita para eluir uncompuesto de la columna:

Ve = Vo + KdVi

Kd indica la fracción del volumen interior accesible a un compuesto específico y es independiente de la geometría de la columna:

Kd = Ve - Vo = Ve - Vo
Vi aWr

Si una molécula es totalmente excluida del gel, entonces Kd = 0 y Ve = Vomientras que si la molécula penetra completamente en el gel, entonces Kd = 1 y Ve = Vo + Vi. Por consiguiente, las moléculas normalmente tienen valores de Kd entre 0 y 1. Si Kd es mayor que 1, entonces ha tenido lugar la adsorción del compuesto sobre el gel.

La diferencia entre el volumen de elución (Ve) de dos sustancias se representa por el valor Vs:
Vs = Ve1 - Ve2Para obtener una separación completa, el volumen de la muestra no debe ser mayor de Vs. Para fines prácticos se recomienda que el volumen de la muestra esté entre 2-5% del volumen total de la columna (Vt).

Entre los geles disponibles comercialmente están los de Sephadex, Sepharose, Sepharose CL, Sephacryl, Biogel P, Biogel A, Bio-glass y Bio Beads. Cada uno de ellos se presenta en...
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