Cuantificacion de proteinas

Practica 1
Curvas Estándar y Concentración

Introducción:

Existen varios métodos para la cuantificación de proteínas, todos basados en alguna de las propiedades de las proteínas, ya sean los patrones de absorción de las radiaciones magnéticas de los grupos aromáticos, la reactividad del enlace peptídico, su contenido de nitrógeno, la formación de derivados químicos, etc. Dependiendo de lasustancia a tratar, la exactitud requerida, la disponibilidad de equipo y material, es el método que se usara ya que cada uno tiene sus respectivas ventajas y limitaciones.

Nos enfocaremos en el método de Lowry, el cual es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas, que tiene como ventajas que es relativamente rápido, tiene mucha sensibilidad, es 100 veces mássensible que el de Biuret, sus limitantes es que se requiere de muchos cuidados en la estandarización, el color no es siempre proporcional a la concentración, la intensidad de color varia entre proteínas, además de haber interferencia de sacarosa, lípidos, amortiguadores de pH, monosacáridos y hexosaminas, debido a que reaccionan con los reactivos de Lowry, asi como las altas concentraciones deazúcares reductores, sulfato de amonio y compuestos con sulfidrilo que pueden interferir con la reacción.

Su principio de reacción consta de dos etapas. La primera, los iones Cu2+, en un medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+proteína tienen un color azul claro. También se provoca el desdoblamiento de laestructura tridimensional de la proteína, por lo que se exponen los residuos fenólicos de tirosina. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo tartrato.

En el segundo paso se da la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau, cuyo principal constituyente es el ácido fosfomolibdotúngstico, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, donde el cobre actúa comocatalizador, esto da lugar a un complejo de color azul intenso.

El método utilizado para esa cuantificación es la realización de una curva estándar mediante las mediciones de absorbancia con un espectofotòmetro de sustancias con concentración conocida de proteína. De esta manera al medir la absorbancia de sustancias desconocidas, es posible saber la concentración de estas sustancias mediante laecuación obtenida por la curva estándar.

Objetivos:

Aprender a realizar y utilizar curvas estándar para determinar concentraciones específicas de soluciones desconocidas así como conocer y utilizar las diferentes formas de calcular concentraciones.

Materiales:

Micropipeta
Espectrofotómetro y celdas
15 Tubos de ensaye de 10 ml
2 Pipetas de 5 ml
Vaso de precipitados de 250 mlGradilla metálica
Solución de BSA 0.5 mg/ml
Solución A (proteína de concentración desconocida)
Solución B (proteína de concentración desconocida)
Reactivo C de Lowry

Método:


Curva de proteína por el método de Lowry
1. Se prepararon los tubos del 1 al 7 para la curva estándar, con una solución de 0.5 mg/ml de albúmina sérica bobina (BSA) como se muestra en la tabla I, después seadiciono el agua necesaria para tener un volumen final de 200ml. Para los tubos problema (8, 9, 10, 11,12) se utilizaron 200 ml de las soluciones de concentración desconocida (A, B, C. D, E).


Tabla I


|Tubo |µl de BSA |µl de H2O |Sol. C de Lowry |A550 |
|1 |0 µl |200 µl |1 ml|0.043 |
|2 |10 µl |190µl |1 ml |0.174 |
|3 |20 µl |180 µl |1 ml |0.077 |
|4 |30 µl | 170 µl |1 ml |0.131 |
|5 |50 µl...