Determinación cuantitativa de aminoacidos

LABORATORIO DE BIOQUIMICA II
DETERMINACION CUANTITATIVA DE AMINOACIDOS
METODO DE LA NINHIDRINA
1.- GENERALIDADES SOBRE EL METODO DE LA NINHIDRINA.
DETECCION Y MEDICIÓN CUANTITATIVA.
La ninhidrina es un poderoso agente y reactivo común para visualizar las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis, también es utilizada con fines cuantitativos para la determinaciónde aminoácidos. Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuantra entre 4 y 8, dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del aminoácido.
La reacción con la ninhidrina produce colores que sirven como basepara la cuantificación de todos los aminoácidos primarios se evalúa midiendo la absorción de la luz con la longitud de onda de 540 nm.
REACTIVO DE NINHIDRINA: Disuélvanse 400mg de cloruro estannoso en 250 ml de amortiguador citrato 0.2 M, pH 5.0 (4.3g de ácido cítrico más 8.7g de citrato trisódico en 250ml, ajústese a pH 5.0 con NaOH o HCl). Añádase esta solución a de metil celosolve (etilénglicol monometil éter), en los que se han disuelto previamente 10g de ninhidrina.
CURVA ESTANDAR
Número de tubo | Aminoácido (1mM) ml | Amortiguador Ml | Reactivo de Ninhidrina ml |
1 | 0.1 | 0.4 | 1.5 |
2 | 0.2 | 0.3 | 1.5 |
3 | 0.3 | 0.2 | 1.5 |
4 | 0.4 | 0.1 | 1.5 |
5 | 0.5 | 0.0 | 1.5 |
Blanco | 0.0 | 0.5 | 1.5 |

Después de añadir la ninhidrina, agítese ycolóquese en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos. Terminando el calentamiento, enfríese en un baño de agua y añádase 8ml de n-Propanol al 50%. Vuélvase a agitar los tubos, déjense en reposo 10 minutos para que se desarrolle el color y léase a 570nm contra un blanco.
2.- ESTRUCTURA DE LA NINHIDRINA Y COMPLEJO RESULTANTE AL REACCIONAR CON EL AMINOÁCIDO.

3.- OTRO METODO PARA LADETERMINACION CUANTITATIVA DE AMINOACIDOS.
METODOS PARA DETERMINAR CUANTITATIVAMENTE A LOS AMINOACIDOS.
Hay diferentes métodos para determinar cuantitativamnete a los aminoácidos como lo son, las cromatografias, electroforesis y otros métodos en el que participan tanto las cromatografias como reacciones con dinitrofluorobenceno y fenilisotiocianato.
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.
El cambio ionicosucede cuando los constituyentes ionicos de la manera se retienen selectivamente por intercambio con sus iones sustituibles del empaque. Este fenomeno de iones puede definir como que posee grupos ionicos fijos y grupos ionicos móviles. Estos últimos pueden ser sustituidos por otros, bajo condiciones especificas.
La cromatográfia de intercambio ionico consiste en intercambiar iones de la faseestacionaria, la cual es un polímero con iones lábiles (cationes o aniones) de estructura porosa, insolubles, pero capaz de aumentar su volumen al ser humedecidos.
CROMATOGRAFÍA CUANTITATIVA DE CAPA FINA
Existen varios métodos para medir la cantidad de un componente individual en una mancha. Un método general es raspar el absorbente que rodea a cada mancha con una navaja o puede limpiarse con agua,proceder a analizar el constituyente de la muestra por algún método espectrofométrico o colorimétrico. También es posible usar un método microanalítico, como una microtitulación.
El segundo método consiste en analizar directamente el compuesto sobre la placa. Suele utilizarse un aparato llamado densitómetro. Si el compuesto es fluorescente, puede utilizarse un tipo de fluorómetro para medir lacantidad de fluorescencia que emite la mancha.
CROMATOGRAFIA EN PAPEL.
Esta técnica se basa en el principio de que un compuesto se reparte o distribuye entre dos fases líquidas. En un ambiente que contiene vapor de agua, el papel de cromatografía absorbe una cantidad de agua que mantiene entre las fibras de la celulosa del papel. Esta agua se considera como uno de los disolventes y constituye la...