Determinación de Proteínas por el método de Lowry

Determinación de Proteínas por el método de Lowry
Objetivo: Realizar una cuantificación de proteínas por el método de Lowry.
Aprender el uso del espectrofotómetro
Determinar una curva decalibración

Marco teórico:
La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que mas frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica. Primitivamente, lacantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrógeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un métodolargo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de métodos calorimétricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes.
Entre los métodos calorimétricos destacan tres: el método deBiuret, el método de Lowry y el método de Azul de Coomasie. En esta práctica nos ocuparemos únicamente del segundo de ellos. Tiene la ventaja de ser extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades delorden de 10 microgramos de proteína; su inconveniente principal es que al evaluar, como veremos, los fenoles presentes en la proteína (esencialmente residuos de tiroxina), la intensidad del colorresultante varia entre las distintas proteínas.
El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejocoloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la
ley de Lambert-Beer A= ε.l.c
Este método consta de dos etapas:
1) Los ionesCu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan eldesdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución...