Determinación de proteínas por el método de lowry

Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Asignatura: Curso Práctico de Métodos de Análisis

Docente: Q.B.P. Espinosa Lara Mercedes

Estudiante:
Sta.Maria Peregrino Abraham Eliud
5QM1
Carrera: Químico Bacteriólogo y Parasitólogo
Sección: II

Reporte de Práctica
Determinación de Proteínas por el método de Lowry

Objetivos:
El alumno:
* Elaboraráuna curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.
* Determinará si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry.
* Conocerá el efecto de sustancias no proteínicas en el desarrollo de color.
* Analizará las ventajas y desventajas del método de Lowry, con respecto a otrosmétodos para la cuantificación de proteínas.
Introducción
El método de Lowry se basa en la reacción del reactivo de Folin con determinados aminoácidos de las proteínas para dar una coloración, este método supone dos reacciones, primero la formación de un complejo de estructura plano-cuadrada entre el enlace peptídico de las proteínas y el cobre (Reacción de Biuret), y una segunda reacción de óxidoreducción reactivo de Folin (ácido fosfomolíbdico-fosfotúngtico) por el complejo de cobre-proteínas, en particular, por los grupos aromáticos de los aminoácidos Tirosina, Fenilalanina, Triptófano. Esta segunda reacción ayuda a intensificar el color obtenido de acuerdo a la concentración de proteínas en la muestra, y se lee en espectrofotómetro a 590nm de longitud de onda.
Ley de Bouguer y Beer(Beer-Lambert-Bouguer)
Es la ley fundamental que relaciona la concentración de una molécula en disolución con su capacidad de absorción, y es resultado de la combinación de las leyes de Lambert-Bouguer y la de Beer.
La ley de Beer predice el efecto de la concentración de un sistema sobre la fracción de radiación que éste absorbe. Beer, en 1852, utilizó radiaciones monocromáticas y paralelas, asícomo disoluciones de diferentes concentraciones de una determinada molécula, pero mantuvo constante el recorrido de la radiación. Observó que un aumento lineal de la concentración se reflejaba en una disminución exponencial de la transmitancia.
Las condiciones de la ley de Beer-Lambert-Bouguer son: que la radiación sea monocromática y paralela, que el medio sea isótropo (todas las direcciones sonequivalentes en la propagación del campo) y homogéneo, que el recorrido de la radiación sea uniforme, que el único tipo de interacción entre la radiación y la disolución sea la absorción, y que los solutos se comporten de manera independiente entre sí.
Método de Lowry
El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade unreactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer
Este método consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro.Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción.
El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.
2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina,presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Figura 1. Reacciones del método de Lowry

Resultados
1. Elaboración de la Curva de Calibración
Tabla 1....