DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS.


TRONCO COMUN DIVISIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD.


PRACTICA No. 2
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS.
METODO DE BIURET

MODULO: ENERGIA Y CONSUMO DE SUSTANCIAS FUNDAMENTALES.


GENERALIDADES:
• Investigación bibliográfica de los estudiantes sobre colorimetría y punto isoeléctrico de proteínas.

OBJETIVO:
• Manejar en el laboratorio el método de Biuret para determinarproteínas.
•Observar y determinar experimentalmente el efecto del pH sobre las proteínas de la leche.

MATERIAL POR EQUIPO:
1 probeta de 50 ml
2 gradillas
2 pipetas de 10 ml
3 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 1 ml
Tubos de 15 x 100 – 12 piezas
1 vaso de precipitados de 100 ml
12 tubos de 16 x 150
1 balanza granataria
Papel parafilm para 10 tubos
Si es necesario, 1 embudo y papelfiltro.

REACTIVOS POR EQUIPO:
Agua destilada.
Solución de ácido acético 0.1 N
Solución de acetato de sodio 0.1 N
Solución de caseína (concentración 4 mg/ml)
Reactivo de Biuret 50 ml.

APARATOS POR EQUIPO:
1 centrífuga clínica
1 balanza granataria
2 espectrofotómetros
4 celdas
1. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO.
1.1. Preparación de una serie de tubos con soluciónamortiguadora de acetatos.

Coloca en una gradilla 6 tubos de 15 x 100 rotulados con números consecutivos. Adiciona a cada tubo las soluciones ácido acético y acetato de sodio que indica la siguiente tabla: TUBO
Solución ácido acético 0.1 N
Solución acetato de sodio 0.1 N
1
5 ml
2
4 ml
1 ml
3
3 ml
2 ml
4
2 ml
3 ml
5
1 ml
4 ml
6
5 ml

2. PREPARACIÓN DE LA LECHE

2.1. En unvaso de precipitados de 100 ml disuelve 6 gr. De leche en polvo descremada, con 50 ml de agua destilada.
NOTA: añade el agua poco a poco para evitar que se formen grumos que podrían dificultar la obtención de una solución homogénea. No debes calentar la leche para disolverla.
2.2. En un tubo de ensaye de 16 x 150 mm mide 2 ml de la leche rehidratada preparada como se indicó anteriormente y añade8 ml de agua destilada, agita cuidadosamente por inversión. Esta muestra de leche diluida (1:5) se ocupará para llevar a cabo la determinación del punto isoeléctrico de las proteínas descrito
en el siguiente párrafo:

3. PUNTO ISOELÉCTRICO.

3.1. Añade 1 ml de la leche diluida (1:5) a cada tubo de solución amortiguadora que preparaste en el punto 1.
3.2. Mezcla cuidadosamente porinversión todos los tubos y deja reposar por espacio de 10 minutos. Observa el aspecto de las mezclas preparadas. En el tubo donde observes grumos de leche suspendidos en la solución te indicará que las proteínas de la leche se han insolubilizado debido al pH de la solución este pH es denominado PUNTO ISOELÉCTRICO.
3.3. Centrifuga los tubos a 2500 r.p.m. durante 10 minutos NO SIN ANTES BALANCEARLOS.Deberá pesar lo mismo que aquel tubo que ocupará el lugar opuesto dentro de la centrifuga.
3.4. Separa el sobrenadante (cuidando de no resuspender el precipitado acumulado en el fondo del tubo) y transfiere a tubos limpios de 15 x 100 rotulalos con el número de tubo que les corresponde.

4. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS CON EL METODO DE BIURET.

4.1. Coloca en una gradilla 11 tubos de 16 x 150mm, rotula uno de ellos como número cero, el cual llevará los reactivos para calibrar el espectofotómetro (blanco de reactivos o testigo) los siguientes 4 tubos llevarán números consecutivos del 1 al IV y los restantes (del 1 al 6) los rotularás con el número que corresponda a los sobrenadantes obtenidos por centrifugación según se indicó en el punto 3.4.
4.2. Añade a cada tubo los reactivospara determinar proteínas en la curva de calibración (tubos I a IV) y en los sobrenadantes (tubos 1 a 6) de acuerdo a lo indicado en la siguiente tabla:


CURVA DE CALIBRACIÓN TUBOS PROBLEMA Tubo
0
I
II
III
IV
V
1
2
3
4
5
6
Solución Patrón
4 mg/ml
0 ml
0.2 ml
0.4 ml
0.6 ml
0.8 ml
1 ml
0
0
0
0
0
0
Sobrenadante
0
0
0
0
0
0
0.5...