Determinacion de los parametros

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DETERMINACION DE LOS PARAMETROS
CINETICOS DE LA INVERTASA

INTRODUCCION:

El estudio de la actividad invertasa presenta un gran interés tanto desde un punto de vista académico como de investigación aplicada, siendo uno de los enzimas más conocidos. A modo de ejemplo podemos referir que la invertasa fue el primer enzima cuya cinética se estudio a profundidad y que fue utilizadoindustrialmente.
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética y de la dinámica química de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otrotipo de moléculas.
Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catálisis no muestra un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la concentración de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reacción (representado como V) aumenta linealmente con elaumento de la [S]. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima (Vmax), que no sobrepasará en ningún caso, independientemente de la [S].
Dos parámetros de suma importancia en el estudio de las reacciones catalizadas por enzimas son la velocidad máxima (V max) a la que una enzima es capaz de trabajar y la constante de afinidad (Km) que nosexpresa precisamente la relación de afinidad que tiene una enzima y su sustrato. Ambos conceptos y los cálculos elementales que llevan a ellos se le deben al trabajo pionero en el área de Michaelis-Menten. 

Para la determinación de la actividad invertasa se utilizará un ensayo indirecto en el que los productos de reacción serán detectados espectrofotométricamente tras su conversión enderivados coloreados. En concreto, la extensión de la hidrólisis enzimática de sacarosa (azúcar no reductor) en glucosa más fructosa (azúcares reductores) se valorará mediante uno de los diversos métodos existentes para la estimación de azúcares reductores. Nos referimos exactamente al método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosau otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo).

OBJETIVO:

Entender la metodología de la determinación de los parámetros cinéticos de una enzima mediante las velocidades iníciales de reacción a diferentes concentraciones de sustrato.

Azucares Reductores[mg/L] |
Concentración [g/L] | D.O [nm] | Promedio | Conc [mg/L] | Azúcares prod. [mol/L] | Sac.Hidrol [mol/L] |
S1 | 1 | 0,06 | 0,06 | 0,064 | 230,8 | 0,0013 | 0,0006 |
S2 | 2 | 0,15 | 0,17 | 0,1675 | 437,8 | 0,0024 | 0,0012 |
S3 | 4 | 0,26 | 0,22 | 0,2455 | 593,8 | 0,0033 | 0,0016 |
S4 | 6 | 0,32 | 0,43 | 0,38 | 862,8 | 0,0048 | 0,0024 |
S5 | 10 | 0,39 | 0,52 | 0,457 | 1016,8 | 0,0056 | 0,0028 |
S6 | 12 | 0,51 | 0,69 | 0,6 | 1302,8 | 0,0072 | 0,0036 |
S7 | 18 | 0,58 | 0,69 |0,638 | 1378,8 | 0,0077 | 0,0038 |
S8 | 25 | 0,68 | 0,65 | 0,6655 | 1433,8 | 0,0080 | 0,0040 |
S9 | 35 | 0,63 | 0,73 | 0,684 | 1470,8 | 0,0082 | 0,0041 |
S10 | 50 | 0,61 | 0,66 | 0,639 | 1380,8 | 0,0077 | 0,0038 |
S11 | 65 | 0,849 | 0,637 | 0,743 | 1588,8 | 0,0088 | 0,0044 |

PROTEINA SOLUBLE(mg/L) |
D.O.(nm) | Promedio | Dilución | Conc.(mg/L) |
0,1 | 0,0915 | 0 | 3,85099338 |0,083 | | | |

Concentraciones de sustrato [g/L] |
Actividad específica | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | S11 |
Mol sac. Hidrol/ mg prot. Sol.*min | 0,00016652 | 0,00031587 | 0,00042843 | 0,00062251 | 0,000733622 | 0,00093997 | 0,00099481 | 0,00103449 | 0,00106118 | 0,00099625 | 0,00114632 |
| | | | | | | | | | | |
%sustrato consumido | 5,69506494 |...
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