determinacion de metanol
Páginas: 5 (1017 palabras)
Publicado: 20 de junio de 2013
PRÁCTICAS DE LABORATORIO: SESIÓN 5.
Análisis de los resultados obtenidos en el estudio de la inducción de genes proinflamatorios en monocitos de ratón mediante PCR y ELISA.
OBJETIVOS
1.- Realizar la electroforesis en gel de agarosa de los productos de la amplificación de los genes TNF-α e iNOS. Analizar los resultados obtenidos.
2.- Interpretar los resultados obtenidos mediante latécnica de inmunodetección ELISA.
CONTENIDOS:
1.- Electroforesis de ADN en gel de agarosa.
2.- TRABAJO PRÁCTICO 1: Preparación de un gel de agarosa.
3.- TRABAJO PRÁCTICO 2: Electroforesis de las PCRs de TNF-α e iNOS.
4.- TRABAJO PRÁCTICO 3: Interpretación de los resultados de las PCRs y del ELISA.
1.- Electroforesis de ADN en gel de agarosa
La concentración e integridad del ADN extraído,así como el tamaño de distintos fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR), pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campoeléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis (Fig.1).
Fig.1: Electroforesis en gel de agarosa
La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN porelectroforesis son reguladas a través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. La agarosa funciona como una red molecular a través de la cual deben pasar los fragmentos, por lo que los fragmentos de menor tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño. Al aumentar la concentración de agarosa, se disminuye el tamañode los poros de la red molecular y se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel.
Los ácidos nucleicos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con colorantesfluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleico. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin embargo, este es un reactivo altamente tóxico, conpropiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis.
La técnica para la cuantificación de ADN consiste, simplemente, en la utilización de una secuencia deconcentraciones de solución patrón de ADN con la que se comparan muestras de ADN de concentración desconocida.
La concentración de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamaño del segmento de ADN que se desee visualizar. Los segmentos de gran tamaño, el del ADN total (proveniente de una extracción de ADN), deben resolverse con concentraciones del 0,8% y a voltajes de60V para evitar la fragmentación del mismo. Los segmentos de 1.500 pb en adelante se resuelven con geles al 1%; los segmentos de 500 pb a 1.500 pb en geles 1,5% o 2% y los pequeños segmentos de 100 pb a 500 pb (los microsatélites, por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede variar de 20V a 120V dependiendo de la velocidad a la que se desee que migre el ADN. Cuanto más alto es...
Análisis de los resultados obtenidos en el estudio de la inducción de genes proinflamatorios en monocitos de ratón mediante PCR y ELISA.
OBJETIVOS
1.- Realizar la electroforesis en gel de agarosa de los productos de la amplificación de los genes TNF-α e iNOS. Analizar los resultados obtenidos.
2.- Interpretar los resultados obtenidos mediante latécnica de inmunodetección ELISA.
CONTENIDOS:
1.- Electroforesis de ADN en gel de agarosa.
2.- TRABAJO PRÁCTICO 1: Preparación de un gel de agarosa.
3.- TRABAJO PRÁCTICO 2: Electroforesis de las PCRs de TNF-α e iNOS.
4.- TRABAJO PRÁCTICO 3: Interpretación de los resultados de las PCRs y del ELISA.
1.- Electroforesis de ADN en gel de agarosa
La concentración e integridad del ADN extraído,así como el tamaño de distintos fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR), pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campoeléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis (Fig.1).
Fig.1: Electroforesis en gel de agarosa
La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN porelectroforesis son reguladas a través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. La agarosa funciona como una red molecular a través de la cual deben pasar los fragmentos, por lo que los fragmentos de menor tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño. Al aumentar la concentración de agarosa, se disminuye el tamañode los poros de la red molecular y se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel.
Los ácidos nucleicos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con colorantesfluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleico. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin embargo, este es un reactivo altamente tóxico, conpropiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis.
La técnica para la cuantificación de ADN consiste, simplemente, en la utilización de una secuencia deconcentraciones de solución patrón de ADN con la que se comparan muestras de ADN de concentración desconocida.
La concentración de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamaño del segmento de ADN que se desee visualizar. Los segmentos de gran tamaño, el del ADN total (proveniente de una extracción de ADN), deben resolverse con concentraciones del 0,8% y a voltajes de60V para evitar la fragmentación del mismo. Los segmentos de 1.500 pb en adelante se resuelven con geles al 1%; los segmentos de 500 pb a 1.500 pb en geles 1,5% o 2% y los pequeños segmentos de 100 pb a 500 pb (los microsatélites, por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede variar de 20V a 120V dependiendo de la velocidad a la que se desee que migre el ADN. Cuanto más alto es...
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