Determinación de proteínas

Objetivos
Determinar la concentración de proteínas de la leche de vaca descremada, utilizando un espectrofotómetro visible y el reactivo de Bradford.
Reactivos
Reactivo de Bradford:
1. Azul de coomasie G-250
2. Etanol
3. Ácido fosfórico
4. Agua destilada

Albúmina bovina
Leche comercial descremada
Instrumental y equipamiento
Espectrofotómetro visible
Tubos de ensayosMicropipeta
Vasos de precipitados de diferentes tamaños
Procedimiento
Lo primero que se hace es preparar el reactivo de Bradford; este se obtiene mezclando una serie de sustancias en un orden determinado que consisten en:
1. Azul de coomasie G – 250 40mg
2. Etanol 50ml
3. Ácido fosfórico 100ml
4. Agua destilada hasta 1L
En segundo lugar se lleva a cabo la preparación de un patrón de albúmina(disolución madre), el cual se obtiene de disolver 10 mg de albúmina bovina en 10 ml de agua destilada, cuya concentración resultante es 1 mg/ml. Luego se procede a preparar diluciones de la solución madre de diferentes volúmenes (10µl, 20µl, 30µl, 40µl, 50µl, 60µl) en distintos tubos de ensayos. En otro tubo se lleva a cabo la preparación de un blanco. En todos los tubos el volumen final resulta300 µl por el agregado de agua destilada. Por último a cada tubo se le añade 3 ml del reactivo de Bradford y se mezcla.
A continuación se procede a la medición en el espectrofotómetro y confección de curva patrón. Para tomar las mediciones se fija el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm, se ajusta el cero (0) de absorbancia (A) con agua destilada. Se mide el blanco; luego se midela absorbancia de cada uno de los tubos de diferentes volúmenes de solución madre y a los valores obtenidos se le resta el valor correspondiente al blanco. Por último se grafica absorbancia Vs concentración de proteínas.
En tercer lugar se procede a preparar 3 diluciones de la muestra problema, entonces se hace una dilución 1:20 de leche comercial descremada. A partir de la leche diluida preparadaanteriormente se realizan 3 diluciones con diferentes cantidades de dicha leche (20µl, 25µl, 30µl) colocándola en distintos tubos y completando su volumen en 300µl con agua destilada. Luego a cada uno de los tubos se le agrega 3ml de reactivo de Bradford.
A continuación se mide la absorbancia de cada uno de los 3 tubos y al valor obtenido se le resta el correspondiente al blanco.
A partir delos valores de absorbancia obtenido y el grafico de la curva patrón se procede a calcular la concentración de proteínas en cada una de las muestras.
Datos obtenidos
Tabla de absorbancia de la solución madre:

Muestra
Julieta
Graciela
Sebastián
Promedio
Resta de blanco
A0
0,236
0,227
0,229
0,231
____
A10
0,272
0,264
0,262
0,266
0,035
A20
0,334
0,318
0,306
0,319
0,088
A300,355
0,360
0,336
0,350
0,119
A40
0,380
0,370
0,371
0,374
0,143
A50
0,398
0,379
0,368
0,382
0,151
A60
0,408
0,389
0,378
0,392
0,161
Tabla de absorbancia de solución de leche descremada:

Muestra
Julieta
Graciela
Sebastián
Promedio
Resta de blanco
A
0,314
0,332
0,298
0,315
0,083
B
0,322
0,332
0,323
0,326
0,095
C
0,358
0,343
0,340
0,347
0,116Análisis de datos
A partir de los datos obtenidos se procedió a graficar la curva patrón y determinar la concentración de proteínas en la leche
Gráfica de curva patrón:

La ecuación de la recta que mejor aproxima los puntos resulto:
Y=0,0031x
Y el coeficiente de regresión R2 es el siguiente:
R2 =0,8973
Con la ecuación de la recta, y conociendo la absorbancia de las muestras diluidas secalculo la concentración de proteínas de cada una ellas. Se obtuvieron los siguientes valores:
Muestras
Absorbancia
Concentración (µg)
A
0,083
26,8
B
0,095
30,6
C
0,116
37,4
Con los valores de concentración de proteínas hallados para las soluciones diluidas se procede a calcular la concentración en g/100 ml de leche comercial descremada.

Para calcular la concentración de...