digestion de ADN con enzimas de restriccion para analizar su grado de metilacion

Bioquímica
 y
 Biología
 Molecular
 I.


PRÁCTICA 1
EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN Y DIGESTIÓN
CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN PARA SU ANÁLISIS DE METILACIÓN

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
-Familiarizarse con las técnicas fundamentales de aislamiento de ADN, cuantificación y
evaluación de su calidad
-Aprender, mediante técnicas con enzimas de restricción, losfundamentos del análisis las
modificaciones epigenéticas que modulan el genoma
-Descubrir cómo se interpretan los resultados obtenidos de diversas técnicas de análisis del
ADN y sus aplicaciones.
INTRODUCCIÓN
Para aislar ADN de tejidos, los pasos a seguir son: 1) destrucción de la estructura
celular (lisado), 2) separación del ADN soluble de desechos celulares y otros materiales
insolubles (ennuestro caso por centrifugación) y 3) purificación del ADN de interés de las
proteínas solubles y otros ácidos nucleicos. Clásicamente, este último paso se ha hecho
mediante solubilidad diferencial entre el agua y algunos solventes orgánicos (por ejemplo, el
fenol y cloroformo), seguida por la precipitación de etanol. Estos métodos están basados en la
solubilidad del ADN en distintos solventes yen sus diferencias respecto a otros compuestos
celulares: el agua permanece en la fase acuosa superior, mientras no es soluble con altas
concentraciones de sales y etanol y precipita.
Actualmente, la mayoría de los sistemas para la purificación de ADN utilizan columnas
de sílice, debido a la capacidad de los ácidos nucleicos para unirse a la sílice en presencia de
altas concentraciones desales. Estas sales luego se retiran con una base de alcohol para lavar
y el ADN es eluido en una solución de baja resistencia iónica como el agua.
El rendimiento de ADN se puede calcular mediante diversos métodos. Nosotros lo
haremos mediante absorbancia (densidad óptica) y electroforesis en gel de agarosa.
Medir la absorbancia del ADN es rápido y sencillo: se necesita un espectrofotómetroequipado con una lámpara UV, cubetas transparentes al UV (de cuarzo) y una solución de
ADN purificado. Las lecturas de absorbancia se realizan a 260nm (A260) donde el ADN
absorbe la luz con más fuerza. Para su cuantificación, se recomienda que la lectura esté entre
0.1-1.0.

Bioquímica
 y
 Biología
 Molecular
 I.
 Prof.
 Elena
 de
 la
 Casa
 Esperón
 
Sinembargo, el ADN no es la única molécula que puede absorber la luz UV a 260nm.
El ARN también tiene una gran absorbencia a 260nm, y los aminoácidos aromáticos presentes
en la proteína absorben a 280nm. En caso de estar presentes en la solución de ADN, también
contribuirán a la medición total a 260nm. Un método habitual para calcular la pureza del
ADN es mediante la determinación de la absorbancia a260 nm dividida entre la lectura de
280 nm. El ADN de buena calidad estará en el rango de 1.7-2.0 (una razón de ~1.8 es
generalmente aceptada como “pura” para ADN; ~2.0 se considera “pura” para ARN). Una
lectura de 1.6 no implica que el ADN no sea apto para ser utilizado en cualquier aplicación,
pero lecturas inferiores a 1.6 indican una mayor cantidad de contaminantes.

En cuanto a laconcentración, según la ley de Lambert-Beer y en una cubeta de 1 cm de
grosor, 1 unidad de absorbancia a 260 nm equivale a :
ADN de doble cadena

50ug/mL

ARN de cadena sencilla

40ug/mL

oligonucleótidos (cadena sencilla)

30ug/mL

La electroforesis de ADN puede hacerse en geles de agarosa o de poliacrilamida, que
forman matrices porososas que permiten separar las moléculas de ADN deacuerdo a su
tamaño. La agarosa es un heteropolisacárido sulfatado formado por D-galactosa y un derivado
de L-galactosa:

La electroforesis en geles de agarosa se realiza mediante la aplicación de un campo
eléctrico que atrae hacia el polo positivo las moléculas cargadas negativamente de ADN,
como se ilustra en las siguientes figuras:

Bioquímica
 y
 Biología
 Molecular
 I....