DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DE ADN DE PLÁSMIDO Y GENÓMICO


UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS
FACULTAD DE FARMACIA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

PRACTICA N° 6
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DE ADN DE PLÁSMIDO Y GENÓMICO


EQUIPO: N° 1
GRADO: SEXTO GRUPO: B


FECHA DE REALIZACIÓN: 15 DE OCTUBRE DEL 2013
FECHA DE ENTREGA: 22 DE OCTUBRE DEL 2013








Objetivo:
Conocer y utilizar la metodología básica para cortarADN de plásmido puc18 y genómico de E. Coli DH5 (alfa) utilizando enzimas de restricción.
Introducción:
Endonucleasas de restricción también llamadas enzimas de restricción, son proteínas bacterianas que cortan en fragmentos la larga molécula linear del DNA. Las enzimas de restricción son las principales herramientas de la tecnología del DNA recombinante. Una enzima de restricción reconoce unasecuencia específica de nucleótidos, como AGCT, cortando el DNA en los lugares en donde esta combinación de “letras” ocurra. Estas enzimas son aisladas de bacterias y designadas con una secuencia de tres o cuatro letras seguidas por un número romano. Por ejemplo, EcoR1 es una enzima de restricción aislada de la Escherichia coli.
Parece peculiar que una enzima como EcoR1 pueda existir. ¿Por quéuna bacteria producirá una enzima que fragmenta el DNA en una secuencia especifica de nucleótidos? La función de estas enzimas, descubiertas en los años 60 y 70, es la de destruir bacteriófagos o virus que invadan la bacteria. Una vez cortados, los virus se vuelven inofensivos. Las bacterias se protegen de sus propias enzimas de restricción a través de la modificación química de su DNA después dela síntesis. Esta modificación consiste en la adición de un radical metilo en nucleótidos específicos a lo largo de la cadena del DNA. Este proceso es llamado metilación.
Muchos de los nucleótidos en el genoma de la bacteria son químicamente metilados. Una vez metilados, están protegidos de ser digeridos por la enzima de restricción. Siendo así las enzimas de restricción capaces de distinguir elDNA exógeno (del virus) de su propio DNA.
Este sistema, por el cual las endonucleasas de restricción distinguen al DNA exógeno de su propio DNA, puede ser considerado un sistema inmune primitivo de la bacteria. Cómo las enzimas evolucionan hasta obtener este grado de especificidad en destruir el DNA viral en cuanto preserva el DNA bacteriano es desconocido.
La EcoR1, por ejemplo, corta el DNAhumano en 10.000 fragmentos que varían, típicamente, de 1.000 a 20.000 pares de bases. Para que EcoR1 funcione como un agente antiviral en humanos todos esos miles de sitios de restricción deberían ser metilados. La cantidad de energía que sería necesaria para realizar este proceso sería inmensa, la digestión de DNA por enzimas de restricción es un proceso simple. Basta colocar el DNA en contactocon la enzima a una temperatura ideal (generalmente 37ºC) y la enzima inicia el proceso de digestión inmediatamente, cortando el DNA en diversos pedacitos. El número de pedacitos producido es establecido por el número de sitios de restricción reconocidos por la enzima utilizada. La enzima EcoR1, por ejemplo, corta el DNA cada vez que encuentra la secuencia G/AATTC mientras que la enzima HINDIIIcorta en la secuencia A/AGCTT.
Los fragmentos generados a través de la digestión por enzimas de restricción pueden ser analizados a través de la técnica de electroforesis agarosa. Electroforesis es la técnica por la cual los fragmentos de DNA de diferentes tamaños son separados. EL DNA es cargado en un pozo de gel (que tiene aspecto de gelatina) y este es sometido a un campo eléctrico. El DNA semoverá en la dirección del polo positivo ya que la molécula de DNA es negativa debido a la presencia de agrupamiento de fosfatos.
Las enzimas de restricción constituyen una importante herramienta para el biólogo molecular. Las enzimas de restricción constituyen la principal herramienta de la tecnología del DNA recombinante. Gracias a ellas podemos cortar un gen específico que nos interese y...