Dna plasmidico

Objetivos
Comprender las diferencias entre ADN plasmídico y genómico.
Comprobar algunas características del ADN plasmídico.
Reafirmar los conocimientos obtenidos en la clase teórica.
Material
Micropipeta de volumen variable 0.5 – 10 µﺍ
Micropipeta de volumen variable 10 – 100 µﺍ
Micropipeta de volumen variable 0.5 – 10 µﺍ
Puntas de volumen variable 0.5 – 10 µﺍ
Puntas de volumen variable10 – 100 µﺍ
Puntas de volumen variable 100 – 1000 µﺍ
Tubos con tapa de 1.5 ml esteriles
Microcentrifuga
E. coli HB 181 k12 Pglo+
Espectrofotómetro de luz UV
Cámara de electroforesis horizontal
Transimulador
Kit Aurum – Plasmid Mini Kit: Spin Format (Bio Rad®)
Crime Scene PCR Basic Kit (Bio Rad®)

Metodología

Sesión I. Preparación del cultivo bacteriano

1. Colocar un inoculo de100 µl de E. coli Pglo+ a un tubo de 1.5ml con tapa estéril.
2. Incubar toda la noche a 37° C.

Sesión II. Obtención del inserto

1. Colocar un tubo de 0.5 ml para PCR, 20 ml del DNA muestra.
2. Adicione 20 µl de la mezcla de PCR.
3. Realizar la amplificación del inserto de acuerdo al siguiente protocolo:

Proceso Temperatura Tiempo Ciclos
Pre-Desnaturalización 94° C 2 minutosAmplificación Desnaturalización 94 °C 30 segs 40
Alineamiento 52°C 30 segs
Extensión 72°C 1 minuto
Extensión Final 72°C 10 mins

Sesion III. Obtención del ADN plasmídico-restricción enzimática
1. Transferir 1.5ml de E. coli Pglo+ a un tubo de 1.5ml con tapa estéril.
2. Centrifugar 1minuto a 12,000 xg.
3. Remover el sobredonante con cuidado de no perder el botón.
4. Realizar el mismopaso hasta terminar con todo el cultivo.
5. Adicionar 250 µﺍ del regulador de lisis y mezclar por inversión.
6. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos.
7. Adicionar 350 µﺍ de la solución de neutralización y mezclar po inversión.
8. Centrifugar por 5 minutos a 12, 000 xg.
9. Colocar la columna en un tubo de recolección de 2ml.
10. Pasar el sobredonoante a la columna de intercambio ionico.11. Centrifugar 1 minuto a 12, 000 xg.
12. Descartar el filtrado.
13. Adicionar 750 µﺍ De la solución de lavado.
14. Centrifugar 1 minuto a 12, 000 xg.
15. Descartar el filtrado.
16. Centrifugar 1 minuto a 12, 000 xg.
17. Transferir la columna a un tubo de 1.5 ml con tapa.
18. Adicionar a la columna 50 µﺍ De la solución de elución.
19. Centrifugar 1 minuto a 12, 000 xg.
20. Una vezobtenido su producto, realice una dilución de 1:100 con agua estéril.
21. E un tubo de 1.5ml con tapa, colocar 4 µﺍ de la muestra obtenida, 5 µﺍ Del regulador de la enzima y 1 µﺍ de la enzima Eco Ri
22. Incubar a 37°C por 30 minutos.
23. Guardar el material obtenido a -20°C hasta la siguiente sesión.

Sesión IV Medición espectrofotométrica de las muestras (Sambrook and Russel 2006)

1.Realizar una dilución 1:1500 de la muestra de ADN.
2. Colocar 250 µﺍ de esta dilución en una celda para luz UV.
3. Realizar la medición espectrofotométrica a 230, 260, 280 y 320 nm.
4. Utilizar la siguiente relación para obtener la cantidad de ADN presente en su muestra:

[ADN] = Abs260nm * FD 50 µﺍ /ml
Donde [ADN] = Concentración de ADN
ABS260nm = absorbancia de la muestra a 260nm
FD = Factorde dilución
Una solución de dsADN con una concentración de 50 µﺍ /ml debe tener una DO a 260nm igual a 1.0.

La cantidad es de 1.3 con 260 nm


5. Calcular la cantidad de proteínas presentes en la muestra mediante la siguiente relación:

Relación ADN-Proteínas= Abs260nm/Abs280nm
Donde:
Abs260nm= absorbancia e la muestra a 260nm
Abs280nm= absorbancia de la muestra a 280nm
Una relación> 1.5 indica contaminación con proteínas.

La cantidad es de 0.928 por lo que la muestra no esta contaminada con proteinas

6. Calcular la cantidad de compuestos fenólicos presentes en la muestra mediante la siguiente relación:

Relación ADN-Fenoles = Abs230nm/Abs 260nm
Donde:
Abs230nm= absorbancia de la muestra de 230nm
Abs260nm= absorbancia de la muestra a 260nm
Un relación > 0.5...