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Los clones iPS sobre expresa los cuatro factores cuando se analizaron los niveles de ARN, pero sus niveles de proteína fueron comparables a los de las células ES (Figuras 7A y 7B ; Figura S8 ) , lo que sugiere que los clones iPS poseen un mecanismo ( o mecanismos ) que regula fuertemente la proteína los niveles de los cuatro factores . Creemos que se requieren grandes cantidades de los cuatrofactores en la etapa inicial de la generación de células iPS , pero , una vez que adquieren ES estatus como una celda , demasiado de los factores que son perjudiciales para la auto- renovación. Sólo una pequeña porción de las células transducidas muestran como la expresión del transgen apropiada. En segundo lugar, la generación de células pluripotentes puede requerir alteraciones cromosómicasadicionales, que tienen lugar de forma espontánea durante el cultivo o son inducidos por algunos de los cuatro factores. Aunque las iPS - TTFgfp4 clones tenían cariotipos normales en gran medida (Figura 7D), no podemos descartar la existencia de alteraciones cromosómicas menores. Sitio específico de inserción retroviral también puede jugar un papel. Los análisis de transferencia Southern mostró que cadaclon iPS tiene ~ 20 integraciones retrovirales (Figura 7C) . Algunos de estos pueden haber causado silenciamiento o la fusión con los genes endógenos . Más estudios serán necesarios para determinar el origen de las células iPS .

Otra cuestión sin resolver es si los cuatro factores que hemos identificado tienen un papel en la reprogramación inducida por la fusión con células madre embrionariaso la transferencia nuclear a ovocitos . Dado que los cuatro factores se expresan en células madre embrionarias en niveles altos , es razonable especular que están involucrados en el mecanismo de reprogramación que existe en las células ES . Nuestro resultado también es consistente con el hallazgo de que la actividad reprogramación reside en el núcleo , pero no en el citoplasma , de las células ES( Do y Scholer , 2004 ) . Sin embargo , las células iPS no eran idénticas a las células ES , como se muestra por los patrones globales de expresión génica y el estado de metilación del ADN . Es posible que hayamos perdido factores importantes adicionales. Uno de estos candidatos es ECAT1 , aunque su expresión forzada en las células iPS no upregulate consistentemente ES genes marcadores celulares(Figura S12 ) .

Más oscuro es el papel de los cuatro factores, especialmente Klf4 y c- Myc , en la reprogramación observado en ovocitos . Tanto Klf4 y c- Myc son prescindibles para el desarrollo de preimplantación ratón ( Baudino et al . , 2002 , Katz y col . , 2002 ) . Por otra parte , c - myc no se detecta en los ovocitos ( Domashenko et al . , 1997 ) . En contraste , L - myc se expresa enovocitos de la madre . KLF17 y KLF7 , pero no Klf4 , se encuentran en las bibliotecas de secuencias expresadas etiqueta derivados de óvulos de ratón fertilizados . Klf4 y c- Myc podrían ser compensadas por estas proteínas relacionadas. Es muy probable que también son necesarios otros factores para inducir la completa reprogramación y totipotencia en ovocitos .

Es probable que se requieren loscuatro factores de los transgenes para el mantenimiento de las células iPS ya que la expresión de Oct3 / 4 y Sox2 de los genes endógenos mantenido baja ( Figura 7B ; Figura S8 ) . Teníamos intención de probar esto mediante el uso de transgenes flanqueado por dos sitios loxP y se obtuvo un clon iPS ( TTF4gfp4 - 7 ) . Sin embargo , nos dimos cuenta de que estas células contienen múltiples sitios loxP envarios cromosomas , y , por lo tanto , la recombinación mediada por Cre podría causar no sólo la eliminación de los transgenes sino también reordenamientos inter - y intracromosómica . Los estudios con sistemas de expresión condicional , como el sistema de la tetraciclina mediada , están obligados a responder a esta pregunta .

Hemos demostrado que las células iPS pueden diferenciarse in...