Electroforesis en geles de poliacrilamida

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ELECTROFORESIS SDS-PAGE

(Sodio Dodecyl sulfato-Electroforesis en geles de poliacrilamida)

La electroforesis se define como el movimiento de partículas (cargadas) a través de un disolvente mediante un campo eléctrico. Es un método usado desde 1937, pero que en los últimos años se ha convertido en un método de elección para el aislamiento de pequeñas cantidades de proteína. Entre lasdiversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en inglés "polyacrylamide gel electrophoresis"), probablemente la más utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente dodecilsulfato de sodio (SDS).

Parte de un gel (poliacrilamida) y un entrecruzador (bisacrilamida) y dependiendo de la concentración de cada uno de ellos será el tamaño del poro(siendo menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida se use), en presencia de un iniciador y un catalizador, como iniciador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-tetrametilendiamina) y como catalizador el ión persulfato que se añade en forma de persulfato de amonio (APS).

El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separación del gel. Habitualmente los geles sedenominan en función del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen. Así, la mayoría de las proteínas se separan bien en el rango 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de gran tamaño.

La muestra se carga en este gel en presencia de SDS y un agente reductor (éste último cuando no se quiere evidencia actividad y solo se quiere visualizar la proteína ycuantificar pesos moleculares). El SDS es un detergente aniónico que desnaturaliza la estructura secundaria y terciaria de las proteínas. Sin SDS las proteínas diferentes con similar peso molecular podrían migrar diferencialmente debido a las diferencias en su plegamiento. El SDS se une a las proteínas en una proporción 1.4g de SDS/ g de proteína y da a la proteína una carga neta negativa. Así,la relación carga/masa se mantiene constante y la separación de los péptidos se produce en función exclusivamente del peso molecular. Como agente reductor se utiliza Mercaptoetanol o DTT (Dithiothreitol), el cual evita que se reestablezcan los enlaces disulfuro. Se aplica voltaje, ocasionando que los componentes de la proteína migren como una en función de la longitud de la cadena polipeptídica ysean separadas estrictamente en base a su peso molecular. La tasa de migración está directamente relacionada con el tamaño de las proteínas.

El formato minigel (7x9 cm aprox.) presenta ventajas con respecto a los geles más grandes. Por ejemplo:

• Alta capacidad de muestra, suficiente de acuerdo a las necesidades (4µg/carril)

• Requiere menos acrilamida y buffer que los sistemasmás grandes

• Tiempos de corrida más rápidos.



La visualización de las proteínas en el gel se logra mediante varios métodos. Los dos más usuales son tiñendo con Azul brillante de Coomassie y con plata. Los cuales permiten la detección de bandas de proteína en el rango de 50 µg y 5µg respectivamente. El azul de Coomassie es usado más a menudo debido a la simplicidad de su uso y porque lapublicación de protocolos usando esta tinción permite recuperar las bandas de proteína por fuertes análisis.







PROTOCOLO



I. RECETARIO DE SOLUCIONES




Todas las soluciones se preparan con agua destilada o HPLC




• Buffer separador (1.5M Tris-HCl, pH 8.8)

-Disolver 18.152g de Trizma base en 80ml de agua destilada (o HPLC)

-Ajustar pH a8.8 (sin agitar)

-Aforar con agua a 100 ml

-Almacenar a 4°C. Vida útil máxima: 3 meses.



• Buffer concentrador (0.5M Tris-HCl pH 6.8)

-Disolver 3g de trizma base en 45 ml de agua destilada.

-Ajustar pH a 6.8 (sin agitar)

-Aforar con agua a 50 ml

-Almacenar a 4°C. Vida útil máxima: 3meses



• Preparación del SDS

-Para...
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