Separación de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida



Instituto Politécnico Nacional.
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.


Ingeniería Bioquímica.
Cuarto Semestre.


Laboratorio de Métodos de Análisis.




Grupo 4IM2



Práctica de Laboratorio.







Objetivos
Efectuar la separación de proteínas e varías muestras mediante la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida.
Determinar cuál es el tamaño“óptimo” de poro del gel, para la mejor separación de cada una de las muestras.
Resultados
Tabla 1. Características de los electroferogramas a diferentes %T.
%T
Característica
5.5
7.5
10
12.5
Longitud del gel antes de teñir (l) cm
7.2
7.6
7.1
7.8
Longitud del gel después de teñir (l’) cm
8.4
8.5
8.1
8.5
Distancia recorrida por elcolorante (f) cm
6.3
6.4
6
6.5
No. De bandas
Suero
8
15
15
15

Yogurt
1
5
12
6

Clara de huevo
4
9
10
10
Tabla 2. Movilidad electroforética relativa promedio para proteínas ovoalbúmina (clara de huevo), caseína (yogurt), seroalbumina (suero).
%T
Muestra
Valores de m de la proteína seleccionada (cm)
Valor promedio de m (cm)
Movilidad electroforética relativa M
Log (M X 100)5.5
Suero
7
7
7.1
7.033
0.957
1.980

Yogurt
6.3
6.3
6.3
6.3
0.857
1.933

Clara de huevo
7.2
7.3
7.1
7.2
0.980
1.991
7.5
Suero
7.3
7.2
7.2
7.23
1.010
2.004

Yogurt
5.6
5.7
5.6
5.63
0.786
1.895

Clara de huevo
7.2
7.1
6.9
7.1
0.991
1.996
10
Suero
5.5
5.6
5.7
5.6
0.8181
1.915

Yogurt
4.4
4.4
4.4
4.4
0.6428
1.808

Clara de huevo
6.36.4
6.3
6.33
0.9247
1.966
12.5
Suero
4.5
4.6
4.6
4.56
0.644
1.808

Yogurt
3.9
3.8
-
3.85
0.544
1.735

Clara de huevo
5.7
5.7
-
5.7
0.805
1.905



Con los valores del logaritmo de la movilidad electroforética relativa (M) de la proteína elegida en cada muestra, construir la gráfica de Ferguson colocando en el eje de las ordenadas el logaritmo de las movilidadeselectroforéticas relativas y en el eje de las abscisas el %T. Usar un solo grafico para todas las proteínas seleccionadas.


Concluya acerca del tamaño molecular relativo de las proteínas y sus cargas eléctricas relativas al pH del regulador de trabajo.
Con la pendiente de las gráfcas de Ferguson observamos los pesos moleculares relativos de cada muestra (tomando los valores absolutos), así tenemosque el suero humano (seroalbumina) es de peso relativo más alto, seguido de el yogurt (caseína) y la clara (ovoalbúmina) con el más pequeño.
Mientras que las cargas eléctricas relativas las compararemos a partir de los valores de la ordenada al origen en las pendientes de los gráficos de Ferguson, Las proteínas del suero humano (Seroalbumina) tiene una mayor carga, seguida por la clara de huevo(ovoalbúmina) y al final el yogurt (caseína)
Informe

1. Diga cuál %T recomienda para la separación de las proteínas de cada muestra ¿Por qué?
Para llevar a cabo la separación de las proteínas del suero y clara de huevo se recomienda el uso del gel de 12.5%T ó 10%T ó 7.5%T ya que se en el que se obtuvo un número de bandas a comparación con 5.5%T, aunque lo discutido en clase nos dictamina queel ideal es el de 12.5%T . Para la separación de las proteínas del yogurt es con el de 10 %T esto es debido a que este gel tuvo un mayor número de bandas. El número de bandas nos hace referencia a las proteínas que se lograron separar de cada muestra.

2. Escriba la reacción completa para la polimerización de la acrilamida y la bis-acrilamida por radicales libre, ¿qué función tiene el TEMED y elpersulfato de amonio?








La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida.


El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice.

El TEMED cataliza la formación de radicales libres que dirigen la reacción a partir del ión persulfato que se añade en forma de APS y...