Electroforesis

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SDS-PAGE:
La electroforesis es una técnica de separación basada en la migración diferencial de especies cargadas en un medio conductor de la corriente eléctrica, bajo la influencia de un campo eléctrico. La separación electroforética depende de la densidad de carga de las moléculas y de su tamaño. Para realizar la separación de proteínas, se realiza lo que se denominaelectroforesis de zona, que se basa en la aplicación de un campo eléctrico sobre un medio estabilizante, como por ejemplo un soporte sólido (soporte electroforético) impregnado de la disolución electrolítica, que dificulta el movimiento libre de los iones. El soporte electroforético tiene que ser un medio mircroporoso (estructura cuyo entramado es tridimensional). Suelen ser de dos tipos:1)soportes norestrictivos, su tamaño de poro no impide el movimiento de los solutos (papel, geles de agarosa, acetato de celulosa); 2)soportes restrictivos, los cuales tienen un tamaño de poro que hace que unos iones puedan entrar y otros no (geles de poliacrilamida). Para la separación de proteínas, los soportes restrictivos ofrecen muchas más ventajas, puesto que presentan:
a)un

gran poder de separación, alpoder hacer geles
b)son

con diferentes tamaños de poro en función de la concentración de acrilamida y del agente de entrecruzamiento, bisacrilamida; químicamente inertes frente a moléculas biológicas; c)son estables químicamente. La técnica con gel de poliacrilamida puede llevarse a cabo en dos condiciones:
a)condiciones

no desnaturalizantes: la separación se hace en función dedesnaturalizantes: se produce la pérdida de

la carga y del tamaño;

b)condiciones

actividad biológica y de la estructura tridimensional debido a la acción de agentes desnaturalizantes, que provocan el desplegamiento de las proteínas, como por ejemplo la urea o el detergente dodecil sulfato sódico (SDS). El SDS es un agente tensioactivo con una cadena carbonada larga hidrófoba y una cabeza cargada.Todas las proteínas enlazan 1,4 g de SDS por gramo de proteína, formando complejos de forma aproximadamente lineal, ya que desdoblan a la proteína uniéndose una molécula de SDS por cada dos aminoácidos. Con esto tendremos la misma densidad de carga, que va a ser prácticamente constante y sólo difieren en su longitud, de acuerdo con el tamaño de la proteína. Por lo tanto, la separación se basaúnicamente en el tamaño de la proteína. Además, todos los complejos tendrán carga negativa y

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migrarán en el mismo sentido. La electroforesis en condiciones desnaturalizantes es el método más utilizado para la separación de proteínas. Para realizar la electroforesis en zona generalmente se utiliza una placa, que es la que contiene el gel de poliacrilamida, y en vertical. La muetra se sitúa en laparte superior, en pocillos de 10-100 µl. Los sistemas utilizados son: tamaño de poro);
2)sistemas 1)

de tampón continuo y gel homogéneo (mismo

de tampón discontinuo y geles no homogéneos. El

tampón va cambiando su naturaleza y el gel su gradiente de porosidad. Este sistema es el más utilizado porque permite concentrar la muestra y aumentar la resolución. En los sistemas discontinuos, enla parte superior (1-3 cm) se coloca el gel de empaquetamiento, cuyo tamaño de poro es grande, no restrictivo, en un tampón de pH aproximadamente de 6,5 y composición distinta del tampón del gel de resolución restrictivo de pH aproximadamente de 8. Las proteínas van a migrar hasta llegar a una zona cuyo tamaño de poror no les deja progresar. Las moléculas de la zona delantera de la banda se frenanmás que las de la trasera, con lo que la banda se estrecha, aumentando de esta forma la resolución.

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REACTIVOS: Gel de Poliacrilamida:

Para 8 ml de poliacrilamida (dos geles de electroforesis) o para un solo gel (4 ml, marcado en azul):

Resolución 7% (µl)
Tris/HCl 1,5 M, pH 8,8 Tris/HCl 0,5 M, pH 6,8 Agua milliQ

Resolución 9% (µl)

Resolución 10% (µl)

Resolución 12% (µl)...