Electroforesis

30/11/2011

TÉCNICAS
INSTRUMENTALES
MÉTODOS

Electroforesis

ÓPTICOS:

–COLORIMETRIA, FOTOMETRÍA,
ESPECTRÓMETRÍA.
–FLUORIMETRÍA.
–POLARIMETRÍA.
–REFRACTOMETRÍA

• MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS
– POTENCIOMETRÍA.
– ELECTROFORESIS

• MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
• MÉTODOS ENZIMÁTICOS.

FUNDAMENTO DE LA
ELECTROFORESIS:
• Todas las biomoléculas tienen una carga
eléctrica específica• La electroforesis se usa como comprobante
de otros métodos y en el análisis
cuantitativo de proteínas, aminoácidos y
ácidos nucleicos.

• la técnica de electroforesis nos permite
separar distintas moléculas de igual tamaño y
estructura pero de diferente carga con ayuda
de una corriente eléctrica.

• Una variante es el ISOELECTOENFOQUE
que sirve para identificar las especies
cárnicas através de bandas proteicas,
separándolas según su punto isoeléctrico
con un gradiente de pH que varía desde el
ánodo hasta el cátodo.

• Las velocidades de migración son función
de la densidad de la carga y también
depende del pH, voltaje, fuerza iónica del
buffer o tampón, etc..

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• Si la partícula está cargada positivamente
(CATIÓN), migrará hacia el polo negativo(CÁTODO).

• Existe una fuerza que arrastra a la partícula,
que es la aplicada por el campo eléctrico y
otra fuerza opuesta al movimiento que es la
viscosidad del Buffer o tampón y el gel.

• Si la partícula esta cargada negativamente
(ANIÓN), migrará hacia el polo positivo
(ÁNODO).

• Las dos fuerzas se equilibran cuando la
partícula empieza a migrar y hace que la
velocidad seaconstante.

Factores que afectan a la
migración.
• A) carga neta de la partícula (como efecto
del pH del buffer o tampón).
• Existe un pH para el cual el número de
cargas positivas es igual al número de
cargas negativas. (carga neta = cero) y se le
conoce como Punto Isoeléctrico (P.I).

• B) Fuerza iónica del tampón.
• Es la concentración del tampón.
• C) Tamaño y forma de la partícula.
•Se retendrán las más grandes y pasarán las
más pequeñas.

• A ese pH la partícula no se moverá, no
migrará.
• A un pH > al P.I. , la partícula poseerá más
cargas positivas que negativas y se
comportará como catión.
• A un pH < al P.I. , la partícula poseerá más
cartas negativas que positivas y se
comportará como anión.

• D) potencial del campo eléctrico.
• La movilidad dependerá delpotencial.
• A mayor potencial aplicado más movilidad.

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SOPORTES
ELECTRÓFORETICOS.
• Hay dos tipos:
• A) Soportes no restrictivos:
• No ofrecen ninguna resistencia y la movilidad dependerá
de la carga de la partícula.
• Pueden ser de papel, acetato de celulosa o agarosa.

• B) Soportes restrictivos.
• Ofrecen alguna resistencia debido al tamaño de
poro del gel ytamaño de las partículas.
• (Pueden ser homogéneos o en gradiente de
concentración). Tipos:
– Geles de almidón.
– Geles de poliacrilamida (acrilamida + bisacrilamida +
persulfato amónico + buffer + temed.)

• Sirven para cuantificación por FOTODENSITOMETRÍA.

• Para aminoácidos ... Papel y acetato de
celulosa.
• Para proteínas .... Gel de poliacrilamida.
• Para ácidos nucleicos .. Gelde agarosa.
• Para inmunoglobulinas ... Gel de agarosa.

PARTES DE LA CUBETA DE
ACIDOS NUCLEICOS

DISTINTAS PARTES DE UN
DESARROLLO
ELECTROFORÉSICO

CUBETA PARA ácidos
nucleicos

CUBETA PARA
EL BUFFER Y
ELECTRODOS

CUBETA
DEL GEL

PEINES

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CUBETA DE ADN O DE ARN

Materiales de Electroforesis de
Proteinas

PARTES DELA CUBETA DE
PROTEINAS

CUBETA DEPROTEINAS

Fuentes
• Buffer :
– Disolución que ayuda a separar la muestra.

• Gel:
– Matriz formada por una sustancia que
polimeriza y en la cual irá incluida la muestra
que va a separarse.

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PASOS PARA LA
PREPARACIÓN DE GELES
• Buffer de carga:

PASOS:
• Preparación de los geles y formación de las cavidades para
las siembras.

• Sustancia que tiene como...