Electroforesis

ELECTROFORESIS DE LA HEMOGLOBINA

INTRODUCCIÓN.
Separación de moléculas en función de su carga eléctrica.
Los aniones (moléculas -) migran al ánodo (positivo).
Los cationes (moléculas +) migranal cátodo (negativo).
Las proteínas son moléculas anfóteras (sin carga). Al introducirlas en un tampón ácido su carga se vuelve positiva. Si es alcalino el medio, su carga es negativa.
MATERIAL-Fuente de alimentación.
-Cubeta.
-Puente.
-Aplicador.
-Medio de soporte (acetato de celulosa).
REACTIVOS
-Solución salina al 0.9%
-Agua destilada.
-Cloroformo para el hemolizado.
-Tampón:ioniza las proteínas (PH =8.8).
-Colorante: Rojo Ponceau.
-Decolorante: solución acuosa de ácido acético al 5%
Ci . Vi = Cf . Vf
80 x Vi = 5 x 1
V= 0.0625l CH3COOH
-Metanol: soluciónconservadora.
HEMOLIZADO
Sangre coagulada con EDTA, retiramos el plasma, lavamos los hematíes.
Hemolizamos los hematíes: 1ml hematíes; 1.5ml de agua destilada y 0.5 de cloroformo. Agitar la mezcla,centrifugar a 3000rpm 20 min.
Retiramos el hemolizado en ependorf.
Determinar la [Hb] y diluir hasta una [5g/dl]
V . 10g/dl =1 ml . 5g/dl
V= 0.5 ml de agua destilada para la [5g/dl]
TÉCNICA
1. Las tirasque estaban en metanol, las pasamos a una cubeta con solución tampón durante 10 min.
2. Se secan con papel de filtro.
3. Se montan sobre el puente, con la cara mate (absorbente) hacia arriba. Laesquina acortada debe estar cercana al analista a su derecha.
4. Añadir tampón a la cubeta de electroforesis hasta cubrir los electrodos.
5. Introducimos el puente con las tiras en la cubeta, demanera que las tiras queden sumergidas.
6. Ponemos la muestra en la regla porta-muestra. Con el aplicador cogemos la muestra, descargamos un poco y finalmente la aplicamos en las tiras de celulosa. 7. Conectamos la fuente de alimentación 200v durante 90 min.
8. Después se decoloran las tiras de ácido acético al 5% introduciéndolas con la cara mate hacia abajo.
9. Transparentamos las tiras...