Electroforesis

Electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa

Maria Elizabeth Ortega Ruiz
Departamento de Ingeniería Agroindustrial, Universidad Politécnica de Guanajuato, Av. Universidad Norte S/N. Localidad Juan Alonso, Cortázar (38483), Gto., México.

Resumen
La agarosa electroforesis en gel es la forma más eficaz de separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños que van desde 100 pb a 25 kb . Laagarosa es aislado a partir de las algas géneros Gelidium y Gracilaria, y consta de agarobiose repetida (L y D-galactosa) subunidades. Durante la gelificación, los polímeros de agarosa asociación no covalente y formar una red de paquetes cuyo tamaño de poro determinar un gel de propiedades moleculares de tamizado. El uso de electroforesis en gel de agarosa revolucionado la separación del ADN.Antes de la adopción de geles de agarosa, el ADN se separó utilizando principalmente de densidad de sacarosa centrifugación en gradiente, que sólo proporcionan una aproximación de tamaño. Para separar el ADN utilizando electroforesis en gel de agarosa, el ADN se carga en prefabricados pozos en el gel y una corriente aplicada. El esqueleto de fosfato del ADN (y ARN) molécula está cargado negativamente,por lo tanto, cuando se coloca en un campo eléctrico, los fragmentos de ADN migrarán a la positivo cargo del ánodo. Debido a que el ADN tiene un uniforme relación masa / carga, las moléculas de ADN se separan por tamaño en un gel de agarosa en un patrón tal que la distancia recorrida es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. El modelo principal para el movimiento de ADN através de un gel de agarosa es "parcial reptación", con lo que el borde delantero se mueve hacia adelante y tira el resto de la molécula a lo largo de La velocidad de migración de una molécula de ADN a través de un gel se determina por el siguiente: 1) el tamaño de la molécula de ADN, 2) la concentración de agarosa; 3) conformación de ADN  4) la tensión aplicada, 5) presencia de bromuro de etidio,6) de tipo de tampón de electroforesis en agarosa y 7). Después de la separación, las moléculas de ADN pueden ser visualizadas bajo luz UV después de la tinción con un colorante adecuado.

Introducción

La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permitenseparar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio. En esta práctica, se pretende que el alumno comprenda elfundamento teórico de esta técnica y sus aplicaciones, llevando a cabo la separación electroforética en gel de agarosa de DNA plasmídico que el mismo alumno va a aislar y purificar a partir de un cultivo bacteriano. Se han desarrollado un gran número de métodos para la purificación de DNA plasmídico de bacterias y todos ellos implican invariablemente tres pasos: crecimiento de la estirpebacteriana portadora, recogida y lisis de las bacterias y purificación del DNA plasmídico. A continuación, el DNA aislado se puede analizar mediante electroforesis en gel de agarosa.


Objetivos de la Práctica
Utilizar la electroforesis de agarosa como método de separación y análisis de ácidos nucleicos
Identifique y ensamble el equipo, material y reactivos para la electroforesis de DNA.
A partirde fragmentos de ADN reales y marcadores de peso molecular, se podrá observar la rápida migración de los fragmentos de menor tamaño, el DNA genómico migra más lentamente debido a su alto peso molecular
Obtener resultados satisfactorios al observar que nuestras corridas de la electroforesis en gel de agarosa se pueden visualizar y podemos hacer una conclusión objetiva.
Identificar su peso molecular de...