Experimento cromatografía

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LABORATORIO Nº 3:
“CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA”
(PARTE A)

INTRODUCCIÓN

La cromatografía es un proceso de separación de los componentes de una muestra; tal separación se efectúa por la distribución que se produce de los componentes de la muestra, entre dos fases, una fase estacionaria y una fase móvil. Los componentes que se mantienen adheridos preferentemente en la faseestacionaria son los más polares, y son retenidos en ella por un tiempo más largo que aquellos con menor polaridad que son distribuidos selectivamente en la fase móvil. Como consecuencia, los solutos son eluidos (separados por arrastre) a través del sistema presentando concentraciones locales en la fase móvil, de acuerdo al orden de sus coeficientes de distribución creciente con respecto a la faseestacionaria. De esta forma se consigue la separación deseada.

La elución se puede basar tanto en interacciones del tipo químico, como también en el efecto de fenómenos físicos de, por ejemplo, campos eléctricos continuos (electroforesis). En este contexto se puede tener entonces una cromatografía ya sea por adsorción, por exclusión, por intercambio iónico, o por electroforesis.

En estaexperiencia se hará una separación por cromatografía de adsorción en capa fina y en columna (Parte A), y luego una cromatografía de gases y una cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) (Parte B)

OBJETIVO:

El objetivo de esta experiencia consiste en separar los distintos componentes de la espinaca por medio de cromatografía de adsorción en capa fina y en columna (CCF y CC respectivamente); enla detección de estos distintos componentes que tienen distinta estructura molecular, con el objetivo de mostrar el efecto de estas cromatografías que se pueden acoplar con técnicas espectroscópicas.

I. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA:

Muestra, Sembrado y Elución En un mortero macere 2 hojas pequeñas de espinaca con 4 a 5 mL de etanol y luego filtre a través de una telafiltrante. Para definir el eluyente más adecuado para la separación, se utilizará la CCF; use 3 trozos de cromatofolio (lámina de cromatografía) de 7,5 x 1,5 cm, trace con un lápiz de grafito una línea suave paralela a un lado menor del rectángulo de la placa a 1 cm de distancia de éste, que será el lado inferior, y marque en ella un punto con su lápiz. Para el sembrado (o depósito) de la muestraintroduzca un capilar en la solución filtrada, retire la muestra obtenida, y toque suavemente la placa de cromatofolio, dejando escurrir unas 3 gotas del capilar sobre la marca en la placa, de forma que cubran alrededor de 2 mm de diámetro.

Prepare una cubeta que contiene un volumen de hexano (de unos 3 mm de altura de éste), otra cubeta con hexano-diclorometano (1:1) y una tercera condiclorometano solo. Luego introduzca el cromatofolio sembrado y “seco” en una de las cubetas cromatográficas y observe el desarrollo (o elución) de la cromatografía. Repita el procedimiento para las otras cubetas.

Revelado (detección). La separación efectuada por la elución de los componentes de la mezcla puede visualizarse irradiando con luz UV el cromatofolio eluído y seco, el que posee unaditivo que es fluorescente a 254 nm, o bien llevándolo a un recipiente saturado con vapores de yodo. Para cada mancha revelada debe determinar su Rf (distancia recorrida desde el punto inicial, sobre la distancia recorrida por el solvente eluyente).

Una vez definido, por la CCF, el eluyente más apropiado, que es el que produce una mejor separación de su muestra, prepare una columna cromatográfica(CC). Para ello ponga en el fondo de la columna una pequeña mota de algodón (de 0,3-0,5 cm de alto), apretándola suavemente para impedir el paso de adsorbente que se va a agregar, pero sin que se constituya en un tapón. Luego agregue 15 g de silicagel, en pequeñas porciones, haciendo vibrar la columna con pequeños golpes de una manguera, para compactar el adsorbente e impedir que queden espacios...
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