Extracción de adn a partir de sangre coagulada

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Universidad Autónoma de Baja California

Campus Valle Dorado
Escuela Ciencias De La Salud

Laboratorio De Biología Molecular

Práctica No. : 1 y 2
“Extracción de ADN a partir de sangre coagulada”
“Electroforesis en gel de agarosa”

Alumna:
Romero Fuentes Gloria Magaly

Fecha de ejecución: 13 de julio de 2011
Fecha de entrega: 22 de julio de 2011

Maestra: Dra. Raquel MuñizSalazar

INTRODUCCIÓN:

Extracción de ADN a partir de sangre coagulada

Las técnicas derivadas de la biología molecular se utilizan de forma creciente tanto con fines básicos como aplicados, fundamentalmente al diagnóstico clínico, partiendo de muestras biológicas muy diversas. Lo cual requiere la extracción de ARN Y ADN (principalmente) así como de otras proteínas y otras macromoléculas.Siendo este un proceso analítico, se desarrolla en 3 fases:
* Pre analítica
* Analítica
* Postanalitica

La obtención de ácidos nucleicos (ADN y ARN) se puede obtener a partir de cualquier célula (excepto glóbulos rojos), ya sea eucariota o procariota. los ácidos nucleicos están atrapados en la célula por lo que se procede a eliminar este impedimento para realizar su análisis. Laseparación de las células se puede hacer mediante la degradación química: la rotura de la matriz extracelular y de las uniones intercelulares se suele realizar por homogeneización isotónica, generalmente en presencia de detergentes no iónicos como el SDS, Triton X-100.

Después de realizar la separación celular, se procede a la lisis de las mismas, en general se realiza con un medio hipotónico, enalgunos casos esta etapa es simultánea con la preparación de la muestra (homogeneización). En la preparación de células sanguíneas es frecuente la aplicación de reactivos de lisis diferencial. Así para el estudio de los leucocitos se lisan los eritrocitos con un medio acido (por ejemplo Liquido de Turck) o una disolución de cloruro amónico.

Mediante centrifugación diferencial se sepansucesivamente núcleos, orgánulos y otras estructuras celulares. Hay tratamientos adicionales o complementarios a los antes descritos para mantener la integridad de las muestras, todo depende del tipo de muestra que deseamos analizar.

Dada la complejidad macromolecular, los ácidos nucleicos son difíciles de separar de los componentes de membrana, proteínas y otras moléculas solubles. Los métodosdrásticos alteran sus estructuras y sus caracteristicas. Por lo que hay muchos métodos suaves elaborados para eliminar la impureza de las preparaciones, todos ellos basados en las propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos.
Electroforesis en gel de agarosa

Electroforesis es una técnica que se basa en la capacidad de las macromoléculas cargadas para desplazarse en un campo eléctrico, convelocidad proporcional a su carga e inversamente proporcional a su tamaño.

Las moléculas de ADN poseen, al pH alcalino habitual, una carga negativa uniforme por unidad de masa, lo que hace que su movilidad hacia el ánodo (+) solo venga determinada por el tamaño de la molécula.

Los cromosomas eucariotas son demasiado grandes para ser identificados por este análisis, por lo que comúnmente seaplica sobre ADN fragmentado con nucleasas.

La separación de los fragmentos de ADN doble se realiza por electroforesis en geles de agarosa (horizontal) o poliacrilamida (vertical). El gel se prepara con distintas concentraciones en función del tamaño de los fragmentos de ADN que se requieran separar.

Los fragmentos más pequeños (hasta 1.000pb) se pueden separar adecuadamente en geles depoliacrilamida; para tamaños mayores (hasta 20Kpb) se usan geles de agarosa. Estos geles forman como mallas o redes porosas moleculares, por donde pasan las moléculas de ADN que puedan atravesarlas. Modificando las concentraciones de estos geles se consigue variar el intervalo de tamaños que es posible separar.

Separadas las moléculas de ADN se visualizan por la fluorescencia de distintos...
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