Extraccion de adn bacteriano

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  • Publicado : 3 de octubre de 2010
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El método que se ha realizado para la extracción del ADN bacteriano se conoce con el nombre de miniprep que se refiere a la extracción de ADN de naturaleza plasmídica de un cultivo bacteriano, en este caso E. Coli. El método más común para ello es romper las células de dicho cultivo mediante un choque alcalino de modo que sólo permee selectivamente su ADN plasmídico. Para ello, se toma unvolumen de un cultivo crecido en medio líquido y se centrifuga, aislando así las células de aquél. Después, se re suspende dicho pellet y se expone dicha suspensión a una disolución que contiene NaOH y dodecilsulfato de sodio (SDS), la cual solubiliza en parte la membrana externa de las bacterias Gram negativas, lo que produce la liberación del contenido celular de éstas: ADN genómico y plasmídicodesnaturalizados, ARN y proteínas Tras esto, se añade a la mezcla acetato potásico, acídico, lo cual neutraliza todo el debris celular y provoca la rápida re naturalización del ADN plasmídico, que queda en suspensión, mientras que el genómico y el resto de componentes celulares se reticulan y precipitan ayudados por la alta concentración de sales, especialmente del recién generado dodecil sulfato depotasio. Finalmente, se centrifuga nuevamente la mezcla para aislar el sobrenadante, rico en el ADN plasmídico y en ARN, el cual deberá ser eliminado mediante una ribonucleasa.
El protocolo proporcionado en la practica muestra un método para la obtención del ADN genómico bacteriano que se ha comparado con el propuesto en el Kit S QuickGene para ADN en Plásmidos para la Para Extracción de ADN enplásmidos de la Escherichia coli (PL-S)
Fuji Photo Film Co., LTD desarrolló y patentó una revolucionaria membrana porosa para inmovilizar ácido nucleico. Debido a su gran área superficial específica, y a su porosidad fina y uniforme, QuickGene extrae satisfactoriamente ADN plasmídico con alto rendimiento; y más aún, con la utilización de su membrana, elimina la mayoría de los contaminantes.QuickGene utiliza la técnica de filtración a presión, la cual no puede utilizarse satisfactoriamente con membranas típicas de fibra de vidrio; utilizando la técnica de filtración a presión se puede usar con gran éxito una nueva instrumentación, compacta y automatizada para la rápida purificación de ácido nucleico.
Utilizando el kit S QuickGene ADN en Plásmidos junto con la serie QuickGene de SistemasAutomáticos de Aislamiento de Ácido Nucleico se podrá extraer y también purificar ADN plasmídico de E.coli con muy alta calidad y rendimiento. Adicionalmente, se pueden extraer simultáneamente y en sólo 6 minutos, 8 muestras de lisado. El ADN plasmídico, de alta calidad, purificado se puede utilizar para secuenciación de ADN, aplicaciones con PCR, digestión con enzimas de restricción, transfección yotras aplicaciones.
Este protocolo utiliza el etanol al 99% en cambio con el que se trabado estaba a una concentración del 70%; el alcohol isopropílico al 70% es el más barato ya que se puede comprar en el supermercado o en la farmacia. Sin embargo, contienen un mayor porcentaje de agua, por lo que es un poco más difícil precipitar el ADN con el. El alcohol etílico al 95% (que es 95% alcohol)trabaja bien. Este hace el ADN más fácil de colectar.
El alcohol en la solución de precipitación se utiliza para remover la concentración residual de sales y promover la precipitación del ácido nucleico. Cuando se trata de muestras con baja concentración de ácidos nucleicos, comúnmente se utiliza un volumen de muestra de isopropanol, en lugar de dos volúmenes de muestra cuando se trabaja conetanol. La
Precipitación del ADN es casi inmediata en presencia de la sal y el alcohol

Se necesitan preparar los reactivos en forma específica como se muestra en la metodología de este protocolo:

Los miembros de la familia del RNase H pueden ser encontrados en casi todos los organismos, de rachea y procariota a eucariota. En Réplica de la DNA, El RNase H es responsable de cortar el RNA...
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