Fotometría

Introducción
​La fotometría o espectrofotometría es una técnica bioquímica utilizada para determinar la concentración de diversas sustancias .La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida desoluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo. La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de lasmoléculas, y es característica para cada sustancia química. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda noabsorbida.
La espectrofotometría usa la luz del espectro electromagnético y usa radiaciones del campo ultravioleta principalmente de 200 a 400 nm y usa la luz visible de 400 a 800 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar las soluciones en la región ultravioleta visible del espectro.
Al campo de luz ultravioleta de 200 a 400 nm se le conoce también como rango de ultravioleta cercano, laespectrofotometría solamente usa el rango del campo electromagnético de la luz visible, de 400 a 800 nm. A este tipo de técnicas se conoce en conjunto como técnicas bioquímicas, en relación a la espectrofotometría se tiene una ley muy importante, la ecuación simplificada de beer-lambert A = ε.d.c comprende a la mínima ecuación que relaciona la concentración (c), la absorbencia de la muestra (A), elespesor recorrido por la radiación (d) y el factor de calibración (ε). El factor de calibración relaciona la concentración y la absorbencia de los estándares. A parte del método de espectrofotometría y fotocolorimetría se tiene los métodos de centrifugación diferencial, electroforesis, análisis de sedimentación, etc.
 
 
 
 
 
Objetivos
 
• Obtener el espectro de absorción de BSA con agentebiuret
 
• Determinar la concentración de BSA en la muestra desconocida de esta proteína usando una curva de calibración.
 
Procedimientos
 
En este experimento se trabajara con la proteína BSA (bovine serum albumin) en agua. Se le proveerá una solución concentrada de BSA (10 mg/mL) y envases con agente biuret, a partir de esta solución prepara sus soluciones diluidas. Los espectros deabsorción se obtendrán en el espectrofotómetro Hewlett-Packard UV/VIS.
 
• Prenda el Spectronic 20 y deje calentar la lámpara por 15min. Luego que el equipo caliente calibre el instrumento.
 
• Limpie 5 celdas. Utilice las pipetas correspondientes para preparar 4 disoluciones que contengan 2, 5, 8 y 10 mg de BSA y llevara la solución a un volumen final de 1 mL con agua destilada. El tubo # 5 leañade 1 mL de la solución desconocida de BSA. Estas serán sus soluciones estándar.
 
• A los 5 tubos (o celdas) se le añadirán 4 mL del agente biuret. Recuerde agitar bien el tubo, deje reaccionar por 30 minutos a temperatura ambiente.
 
• Para calibrar el Spectronic 20 lleve el monocromador a 300NM y con el botón a 300 nm. Luego con el botón de 0%T lleve la aguja del instrumento al 0%T (recuerdeque esto se hace sin celda adentro). Una vez haga esto ese botón no se vuelve a tocar durante el experimento de moverlo tendrá q repetir este paso de nuevo.
 
• Ahora coloque un Tubo (celda) que contenga ¾ de agua destilada este será su blanco y llevara el 100%T a 100%T en la escala del instrumento. Ahora puede comenzar a medir el %T de sus muestras al “Landa Max” (550 nm).
 
• Después que...