Gloria

Trabajos Prácticos 1, 2 y 3

- Preparación de DNA plasmídico de Escherichia coli
- Electroforesis en geles de agarosa
- Transformación de Escherichia coli con DNA plasmídico

IBMC 2010

Atencio Melina
González Juliana
Sosa Sofía
Pereyra Rubén

Trabajo Práctico 1: Preparación de DNA plasmídico de Escherichia coli

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas de DNA doblecadena capaces de replicarse independientemente del genoma de la célula. Están presentes en bacterias (en forma superenrrollada) y en algunas células eucariotas. No son indispensables para la supervivencia de la bacteria pero pueden contener genes que les permitan sobrevivir o crecer en condiciones desfavorables.

El plásmido que se utilizó en este trabajo práctico es el pBluescript II:

[pic]Algunos de los elementos más importantes de este plásmido son:

1) ORI o rep: origen de replicación: La replicación del plásmido puede o no estar sincronizada con la del genoma y es bidireccional o unidireccional. Este proceso utiliza la maquinaria de la célula (la DNA girasa y la DNA polimerasa III o I). Durante la división celular, las moléculas de DNA plasmídico segregan al azar a cadacélula hija y el número de copias por célula de un plásmido es regulado. En este trabajo, se utilizó un plásmido de alto número de copias (de 20 a más de 200 copias por célula). Esto permite la extracción de una gran cantidad de DNA plasmídico a partir de poca cantidad de bacterias.

2) Gen bla: de resistencia a ampicilina para trabajar solamente con bacterias que contienen el plásmido.
3)Polylinker o sitio múltiple de clonado (MCS): región de DNA con múltiples sitios de corte para las enzimas de restricción para introducir el gen de interés en algún lugar concreto.
Los plásmidos en biología molecular pueden ser utilizados como vectores de clonado y vectores de expresión.

OBJETIVOS

El objetivo de este trabajo es analizar e interiorizarse con el proceso de extracción del DNAplasmídico de la bacteria E. Coli. A su vez familiarizarse con el método de extracción de lisis alcalina. El trabajo apuntó a que el DNA plasmídico se extraiga lo suficientemente “limpio” para que de esta forma pueda ser utilizado para su visualización por electroforesis en gel (TP 2) y para transformaciones bacterianas (TP 3).

PROCEDIMIENTOS

A lo largo del trabajo práctico se trabajó con tressoluciones distintas:

Solución 1: Solución de resuspensión.

Solución 2: Solución de lisis alcalina.

Solución 3: Solución de renaturalización.

Recibimos un tubo eppendorf con un pellet resuspendido en 0,3 ml de la solución 1. El pellet correspondía a 1,5 ml de un cultivo bacteriano en la fase estacionaria de la cepa E. Coli con un plásmido de alto número de copias. Se nos entregó el tubo enhielo, para que de esta forma, la temperatura disminuya la actividad de las nucleasas. La función de la solución de resuspensión es resuspender a estas bacterias para que entren en contacto con la solución de lisis. El Tris – HCl contenido en la solución es un sistema buffer que mantiene constante el pH de la solución a 8. El otro componente de la solución, EDTA, es un quelante, es decir uncompuesto químico capas de “fijar” o “secuestrar” iones metálicos. En este caso de cationes divalentes Ca 2+ o Mg 2+, los cuales conforman los cofactores de las nucleasas. De esta manera se inhibe su actividad de degradación de DNA. Al mismo tiempo el EDTA desestabiliza la membrana la membrana externa de las bacterias, ya que los cationes participan de la estabilización de la misma. A su vez, lasolución 1 es isotópica, por lo que el agua tiene tendencia a ingresar a la bacteria y la presión resultante genera cierta inestabilidad en la pared de las mismas.

Se tomaron 0,3 ml de la solución 2 con la micropipeta de 1000 µl, los cuales se agregaron a la solución con bacterias. La solución 2 o solución de lisis alcalina, compuesta por NaOH y SDS, se va a encargar de lisar a las bacterias. El...