Identificación Serológica Y Molecular De Bacteria Fitopatógenas

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

REPORTE GLOBAL

SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD, INOCUIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA

IDALIA MONTESINOS SOLANO

INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA
BOLETA: 2009620221

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M. en C. MARÍA DEL ROCÍO HERNÁNDEZ HERNÁNDEZ

INTRODUCCIÓN

El Servicio Nacional de Sanidad Inocuidad yCalidad Agroalimentaria (SENASICA) es un órgano desconcentrado de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), orientado a realizar acciones de orden sanitario para proteger los recursos agrícolas, acuícolas, y pecuarios de plagas y enfermedades de importancia cuarentenaria y económica, así como regular y promover la aplicación y certificación de lossistemas de reducción de riesgos de contaminación de los alimentos y la calidad agroalimentaria de éstos, para facilitar el comercio nacional e internacional de bienes de origen vegetal y animal.
El SENASICA trabaja conjuntamente con otras secretarías del gobierno federal, con los gobiernos de los estados, el congreso y con las organizaciones de productores, industrializadores y comercializadoresde bienes agropecuarios, acuícolas y pesqueros en el país, así como prestadores de servicios.1

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
El método molecular de identificación bacteriana mediante secuenciación del ADN incluye tres etapas:
i) Amplificación del gen a partir de la muestra apropiada;
ii) Determinación de la secuencia de nucleótidos del amplicón
iii) Análisis de lasecuencia

Amplificación
La amplificación del ADNr 16S se consigue en un termociclador, gracias a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como sustrato se utiliza normalmente ADN purificado a partir de un cultivo puro del agente patógeno. Para la extracción del ADN bacteriano existen protocolos generales, pero pueden requerirse modificaciones, dependiendo de la bacteria. Además, laamplificación también puede conseguirse directamente a partir de una colonia aislada o un cultivo líquido de la bacteria de interés, simplificando significativamente la identificación, al evitar el laborioso proceso de extracción del ADN.

Secuenciación del amplicón
En esta etapa se llevan a cabo las reacciones de secuenciación y el análisis de los productos por electroforesis. Actualmente, se empleala secuenciación cíclica, en una reacción similar a la de amplificación, que utiliza un único iniciador por reacción y terminadores marcados con fluorocromos adecuados, que interrumpirán la síntesis de manera aleatoria, y facilitarán la detección posterior de los fragmentos interrumpidos.
El número de bases generadas por un secuenciador automático es de 500 a 900, dependiendo del capilarutilizado en la electroforesis. Por ello, para la secuenciación de las dos cadenas del ADNr 16S completo, serán necesarios de 8 a 4 iniciadores, dos de los cuales podrán ser los mismos utilizados en la amplificación. La obtención de la secuencia definitiva requiere la evaluación de los electroferogramas y la alineación de la cadena directa con la reversa, para resolver las posibles discrepancias.
Laidentificación de una bacteria a nivel de especie no requiere necesariamente la secuenciación del ADNr 16S completo: la mayor variabilidad se concentra en las primeras 500 bases, correspondientes al extremo 59, necesitándose únicamente 2 iniciadores.

Análisis de la secuencia
La última etapa será la comparación de la secuencia del ADNr 16S con las depositadas en bases de datos. Actualmenteexisten distintas bases de datos, algunas públicas, cuyo acceso es libre a través de internet, como GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), EMBL (European Molecular Biology Laboratory), RDP (Ribosomal Database Project), RIDOM (Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms). RDP (http://rdp.cme.msu.edu/html/) es la principal base de datos de secuencias de ADNr: permite la...