Informe de Agroinfiltración

INTRODUCCIÓN
La introducción de ADN foráneo en las plantas en general, y el uso de Agrobacterium tumefaciens
en particular, representa un hito biotecnológico de enorme relevancia para la agroindustria. El
primer ejemplo experimental de la transferencia de genes por A.tumefaciens fue desarrollado en el
año 1983. Desde entonces, nuestro conocimiento sobre los detalles moleculares delfenómeno ha
ido aumentando hasta permitirnos un ajuste fino del mecanismo de transferencia génica.
En la naturaleza, esta bacteria accede al interior de dicotiledóneas silvestres, y las parasita,
formando tumefacciones y explotando la capacidad biosintética de su hospedador (Figura 1).

Esta habilidad le es conferida por un elemento epigenético (un plásmido) conocido como plásmido
Ti (Figura 2).En la estructura del plásmido Ti se encuentran dos juegos de genes flanqueados por
dos regiones repetidas conocidas como “Borde Derecho” y “Borde Izquierdo” (en marrón en la
Figura 2), necesarias para la inserción en el genoma vegetal. El primero de los juegos presenta
varios genes codificantes para hormonas vegetales (auxinas y citoquininas, en color rojo y verde en
la Figura 2), responsablesde la replicación de las células del hospedador, lo que lleva a la
formación de los tumores. El segundo juego está constituido por una serie de genes codificantes
para la síntesis de opinas (amarillo en la Figura 2), sustancias químicas que sirven de nutrientes a la
bacteria. Por fuera del “cassette” flanqueado por los bordes derecho e izquierdo, se encuentran
genes de virulencia necesariospara la transferencia del plásmido Ti desde la bacteria hacia la
planta, incluyendo la formación de una “jeringa molecular” a través de la cual el ADN es
introducido en el citoplasma de las células del hospedador. Asimismo se encuentran genes
necesarios para la utilización de las opinas como fuente de energía.
Una vez en la planta, las secuencias de los bordes derecho e izquierdo se recombinancon sendas
regiones del genoma de la planta, insertando el cassette completo en su estructura.


En otras palabras, A.tumefaciens es capaz de introducir en la planta hospedadora la información
necesaria para la síntesis de su propio alimento.

Mediante técnicas de ADN recombinante, se ha logrado generar cepas de A.tumefaciens con
plásmidos Ti a los que se les removió el cassette flanqueadopor los bordes izquierdo y derecho.
Paralelamente, estas cepas pueden ser transformadas mediante la introducción de plásmidos Ti
“desarmados”, en que los genes de virulencia y de catálisis de opinas fueron removidos, y los genes
de síntesis de hormonas vegetales y opinas reemplazados por genes de nuestro interés. De esta
manera, la bacteria poseerá dos plásmidos (sistema binario). Uno deellos sintetizará la maquinaria
de transferencia, y el otro aportará los genes de interés para ser transferidos al genoma de la planta.
Luego de la infección, el tejido vegetal transformado se induce hormonalmente a generar un tejido
indiferenciado (callo) a partir del cual se regenerará una planta completa que llevará el gen deseado
en su genoma.
Existen numerosos métodos para la introducción deA.tumefaciens en la planta. Entre ellos se
cuentan los siguientes:
Infección directa: explantos de tejido vegetal (típicamente discos de hoja) levemente dañados con
una jeringa, se incuban durante unos minutos en una suspensión de bacterias.
Infiltración por vacío: los explantos se sumergen en una suspensión de bacterias, y el conjunto se
somete a vacío para eliminar toda traza de aire delinterior de la planta. La ruptura brusca del vacío
genera la entrada masiva de la suspensión bacteriana al interior del tejido vegetal.
Inmersión de flores (floral dip): los capullos de la planta se sumergen en una suspensión de
bacterias por espacio de unos minutos. Las bacterias penetran espontáneamente el tejido floral e
infectan sus células.
Agroinfiltración: una jeringa sin aguja...