Laboratorio 5

Laboratorio nº5
“Determinación de proteínas totales”

Introducción
En el siguiente práctico se utilizara el método de Bradford el cual está basado en el cambio de color del colorante azul de Coomassie en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos especialmente arginina y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínasprovoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm.

Para determinar la concentración de proteína total presente en una muestra se requiere la preparación de una curva de calibrado empleando una proteína patrón, que generalmente suele ser la seroalbúmina bovina.

Objetivo general
* Determinar la concentración de proteínas totales del vino tinto de distintas marcas.Objetivos específicos
* Determinar la composición de diferentes marcas de vino tinto, calcular su longitud de onda, su absorbancia y la concentración de nuestra muestra.

Materiales
Gradilla | Tubos de ensayo |
Agitador de muestras Vortex | Micropipeta (100-1000 proline BiohiT) |
Matraz aforado ( Labor Therm) | Cubeta |
Tips | Cloro |
Espectrofotometro Sunny UV=7804C | Vasoprecipitado (600 mL- Schott Duran) |
Agua destilada | Detergente |

Reactivo |
Bradford |
Muestra |
Vino tinto Clos |
Vino tinto 120 |
Vino tinto gato |

Procedimientos
Importante: se debe encender el espectrofotómetro 15 min antes de ocupar para que esta se estabilice, luego escoger la longitud de onda que seria 595 nm.
Identificación de proteínas
* Se toman 0,5 ml del vinoy se depositan en un tubo de ensayo, luego se agregan 2,5 ml del reactivo de Bradford, y se lleva al agitador para que la muestra quede homogénea.
* Luego se deposita en una cubeta, y se lleva al espectrofotómetro, para medir su absorvancia.

Curva de calibración
* Se agrega a un matraz aforado 0,5 ml de la solución patrón (SAB) y se adiciona agua hasta el aforo.
* Luego se toma untubo de ensayo y se agregan 0,5 ml de la dilución y 2,5 de Bradford.

Datos experimentales
Solución patrón(mg/L) | Absorvancia para curva de calibración | Absorvancia para identificación de proteínas | Muestra de vino tinto |
10 | 0,028 | 0,255 | |
20 | 0,045 | 0,285 | |
30 | 0,102 | 0,305 | Gato |
40 | 0,083 | 0,318 | Gato |
50 | 0,141 | 0,222 | Santa Helena |
60 | 0,303 |0,220 | Santa Helena |
Tabla 1. Se observa valores los cuales ocuparemos para hacer la curva de calibración y para calcular la cantidad de proteínas presente en la muestra de vino tinto.

Datos bibliográficos

Método de Bradford:

Fundamento: Este método constituye una forma rápida y confiable para la determinación de proteínas. Se basa en la cuantificación de la unión del colorante AzulBrillante de Coomassie a una proteína desconocida y la comparación de esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína standard. El complejo colorante - proteína presenta un máximo de absorción a 595 nm. Solución de Azul brillante de Coomassie: 100 mg de Azul Brillante de Coomassie G-250 + 50 ml de etanol al 95 % + 100 ml de ácido fosfórico al 85 %. Llevar a 1 litro con H2O. Filtrar conpapel Whatman.

N° 1. Conservar a 4 °C.

Técnica:

Agregar distintos volúmenes de la muestra, completando a 0,5 ml con H2O, mezclar y adicionar 0,5 ml de Azul Brillante de Coomassie. Respetar el orden 3del agregado de los reactivos. MEZCLAR y leer absorbancia a 595 nm en un lapso de tiempo de entre 2 minutos y 1 hora. Testigo: BSA 0,1 μg/μl Sensibilidad: 1-10 μg de proteína en el volumenfinal de la determinación. Curva de calibración sugerida: 1; 1,5; 2; 2,5; 3 y 3,5 μg del testigo. NOTA: dada la alta sensibilidad del método, verifique antes de comenzar a trabajar que los tubos estén limpios.

Ejemplos de cálculo
El cálculo que se muestra a continuación son los valores de SAB a utilizar, el cual se debe realizar con cada una de las muestras. Utilizando la siguiente fórmula:...