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Microscopía de fluorescencia.

En la microscopía de fluorescencia se utilizan colorantes para marcar las moléculas de un anticuerpo que luego se puede unir selectivamente a las macromoléculas de una célula. Las moléculas absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten otra longitud de onda más larga. Dependiendo de la molécula fluorescente utilizada tendremos una intensidad y uncolor de luz diferente. Si un componente es iluminado a su longitud de luz absorbente y visualizado a través de un filtro a la misma longitud de onda de luz que emite, este aparece brillante sobre un fondo oscuro.

Estos colorantes son detectados con el microscopio de fluorescencia. Se trata de un microscopio convencional pero con una potente fuente de luz que atraviesa dos filtros, uno parainterceptar la luz antes de llegar a la muestra y otro para filtrar la luz obtenida de la muestra. El primer filtro solo deja pasar aquella luz que nos permitirá ver las moléculas con un determinado colorante fluorescente, y el segundo bloquea esta primera luz y deja pasar la luz fluorescente que emite el colorante.

Sobre todo, la microscopía de fluorescencia se utiliza para detectar proteínas uotras moléculas en células y tejidos. Normalmente se utilizarán dos colorantes: la fluoresceína, que se excita con luz azul y deja una fluorescencia verde-amarilla y la rodamina que se excita con luz verde-amarilla y da lugar a una fluorescencia de color rojo.



Microscopía electrónica de barrido.

El microscopio de barrido confocal utiliza métodos electrónicos de imagen que permiteneliminar la luz superior e inferior de una fina muestra y centrar el foco de luz en el plano de la muestra. De esta forma se puede obtener una fina sección óptica de la muestra. Si realizamos diferentes secciones ópticas a diferentes profundidades, se puede construir una imagen tridimensional a partir de las mismas con la ayuda de un ordenador. La luz que se utiliza en este microscopio es a menudo unaluz laser que pasa por un diafragma y produce puntos luminosos muy brillantes que en lugar de iluminar toda la muestra ilumina un punto a una profundidad determinada. El detector recogerá solo la luz de los puntos brillantes ignorando la luz externa al foco. Se recoge secuencialmente la información de cada punto luminoso del plano focal mediante un barrido por todo el campo a observar y de estaforma se obtiene una imagen bidimensional. Este sistema de microscopio de barrido confocal, se ha utilizado sobre todo para resolver las estructuras de numerosos objetos como las redes de fibras del citoesqueleto del citoplasma y la disposición de los cromosomas y de los genes en el núcleo.

Como ya hemos visto, mediante la microscopía de barrido confocal se pueden obtener imágenes tridimensionales.Se puede construir el volumen de varias imágenes bidimensionales obtenidas a partir de los diferentes cientos de secciones seriadas, pero esto llevaría mucho trabajo.

Existen sistemas más directos de obtener una imagen tridimensional, para ello podemos utilizar el microscopio electrónico de barrido que utiliza los electrones emitidos a partir de la superficie de la muestra. La muestra se fija,se seca y se recubre con una capa delgada de un metal pesado. El haz de electrones sale de una fuente que lo genera y pasa por un tubo que se encuentra al vacío para que las moléculas de aire no desvíen a los electrones y son conducidos hasta la muestra por la lente condensadora y la lente objetivo. La muestra es barrida por un haz focalizado de electrones que bombardea cada uno de los puntosde la superficie metálica. La cantidad de los electrones emitidos es medida y utilizada para controlar la intensidad del segundo haz coordinado con el primero que forma una imagen muy completa y ampliada de la superficie de la muestra mostrándola en una pantalla de televisión.

Esta técnica proporciona una gran profundidad de foco y aunque muestra imágenes con puntos brillantes y sombras...