Mantenimiento de líneas celulares.

Biología Celular y Molecular. Guía de TP Nro. 2 Mantenimiento de líneas celulares.

Introducción Una de las formas de crecimiento in vitro es el cultivo en monocapa. Cuando las células requieren la adhesión a un sustrato para crecer y dividirse, el crecimiento se realiza en una única capa celular (monocapa). Esta monocapa crecerá hasta alcanzar cerca del 100% de confluencia (máxima capacidad decubrimiento de superficie); pasado esta etapa, el crecimiento se detiene por inhibición por contacto y las células pueden comenzar a degenerar, despegarse y morir. No obstante, algunas variantes de células tumorales son capaces de “apilarse” y dar lugar a multicapas.

Células F3II creciendo en monocapa

Es necesario realizar algunas definiciones para instalar un lenguaje común en el manejo delíneas celulares:

CULTIVO CELULAR: Termino utilizado para denominar el crecimiento de células in vitro, incluyendo el cultivo de células aisladas. En los cultivos celulares, las células no están organizadas en verdaderos tejidos. CULTIVO PRIMARIO: El cultivo iniciado a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo. Un cultivo primario debe ser considerado como talhasta que se subcultive (o repique) con éxito por primera vez. En ese momento se considera una línea celular. DENSIDAD DE SATURACION: El máximo número de células mantenible bajo condiciones específicas de cultivo en un recipiente. Este término se expresa usualmente como el número de células por centímetro cuadrado en una superficie de cultivo o el número de células por centímetro cúbico en uncultivo en suspensión. EFICIENCIA DE SIEMBRA (ADHESION): El porcentaje de células sembradas que se adhieren a la superficie del recipiente de cultivo en un tiempo determinado. Siempre deben establecerse las condiciones bajo las cuales se realizó la determinación. LINEA CELULAR: Una línea celular se origina a partir de un cultivo primario en el momento del primer subcultivo exitoso. El término líneacelular implica que los cultivos de la misma consisten en numerosos linajes de células presentes originalmente en el cultivo primario. Los términos finita o continua son usados como prefijo si se conoce el estado del cultivo. Si no, el término línea es suficiente. El término línea continua reemplaza al término línea establecida. MEDIO QUIMICAMENTE DEFINIDO: Una solución nutritiva para cultivo decélulas siendo conocida la estructura química de cada componente. Aunque se sabe que aún los compuestos químicos puros pueden tener algunos contaminantes, se deben usar compuestos químicos de alta calidad con datos analíticos, si es posible, de los contaminantes. PASAJE (REPIQUE): La transferencia o trasplante de células, con o sin dilución, de un recipiente de cultivo a otro. Se entiende que siempreque las células se transfieren de un recipiente a otro,.una cierta porción de éstas se pierde y que por lo tanto, se produce la dilución de las células en forma deliberada o no. Este término es sinónimo del término subcultivo. PASAJE NUMERO (REPIQUE NUMERO): El número de veces que las células en cultivo han sido subcultivadas. En la descripción de este proceso debe establecerse la relación odilución de las células a fin de determinar la edad relativa del cultivo.

Desarrollo de la práctica

Repique en monocapa Reactivos de cultivo utilizados: MEM (Medio Esencial Mínimo) SFB (Suero Fetal Bovino) Gln (Glutamina) Tripsina + EDTA PBS (Buffer fosfato Salino) Las células utilizadas en este ensayo serán células de carcinoma mamario de origen murino denominadas F3II. Protocolo 1) Observar almicroscopio el frasco (Superficie:25 cm2) que se va a subcultivar para ver si la monocapa es continua y uniforme. 2) Insertar una pipeta de 1 ó 2 ml en la manguera de vacío y descartar el medio de cultivo del frasco. 3) Lavar 3 veces con PBS sin Ca++ ni Mg++ (también puede utilizarse solución fisiológica). 4) Cubrir la monocapa con cantidad suficiente de solución de tripsina + EDTA (0.5 ml...