metabolismo

Universidad de Antofagasta
Facultad Ciencias de la Salud
Departamento Biomédico
Bioquímica







Laboratorio N °1: Determinación de la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa.



Integrantes: Karla Cárdenas
Solange Olivares
Génesis Serrano







Introducción

La lactato deshidrogenasa (LDH) es un enzima NADdependiente que se encuentra ampliamente distribuida en tejidos animales, vegetales y en microorganismos.
La reacción catalizada por la Lactato deshidrogenasa (LDH) que reviste importancia es la reducción del ácido pirúvico a ácido láctico, cuando se combina con dos átomos de hidrógeno. Para describir con precisión los sustratos y los productos del lactato deshidrogenasa se requiere el desarrolloquímico completo de la reacción catalizada por la lactato deshidrogenasa, los sustratos de la LDH son el ácido pirúvico y el NADH2 y sus productos son el ácido láctico y el NAD.
La cantidad de enzima LACTATO DESHDROGENASA determina la cantidad de ATP en ausencia de O2 a las Células, en el caso de las células musculares una menor cantidad de enzima implicaría una velocidad escasa de producción deATP, en algunos animales como la rana leopardo la mayor velocidad de salto de la rana se debe a la presencia de una mayor cantidad de enzima lactato deshidrogenasa.
La LDH es una enzima cercana al equilibrio, por tanto, no reguladora, pero sí regulada por la razón NADH / NAD+ y por la posibilidad de presentar formas isoenzimáticas con características distintas tanto cinéticas como de inhibición porsustrato. La inhibición por exceso de sustrato tiene lugar por la formación de un complejo NAD - piruvato que compite con el NADH por el centro activo del enzima. Asimismo, la LDH presenta inhibición por intermediarios de ciclo tricarboxílico: oxalacetato y citrato. Se conocen otros inhibidores como oxalato y oxamato.










Preparación de material biológico, reactivos y diseñoexperimental para el estudio de reacciones redox de importancia en el metabolismo celular.

Objetivo: Determinación de la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa.

Material biológico a preparar:
Órganos a requerir: Rata muerta por decapitación.
Preparación de enzima lactato deshidrogenasa: Se obtendrá la enzima a partir de tejidos hepáticos y musculares. En ambos casos, el hígado y elmusculo se cortará en pequeños trozos, moliéndose en un mortero en presencia de arena que se utilizara como abrasivo, hasta obtener una pasta fina soluble, utilizándose fosfato de sodio 10 m M, PH 7.4 como amortiguador. La solución obtenida se centrifuga 10 minutos a 10.000 rpm en centrifuga refrigerada. El sobrenadante corresponderá al extracto que contendrá proteínas y moléculas solubles.Eliminación de coenzima presente en el extracto: El extracto obtenido de la forma descrita en le punto 3, se coloca en tubo de ensayo o vaso precipitado limpio y se mantiene en le mesón por 15 minutos a temperatura ambiente. La destrucción de la coenzima NADH y de naturaleza nucleotidica se producirá por la presencia y actividad a temperatura ambiente de nucleotidasas presente en el extracto. Una veztranscurrido el tiempo establecido para la destrucción de las coenzimas, el extracto se conserva a 5°C.
Preparación de la coenzima NAD: extraer los músculos de pata de la rata y colocarlos en un vaso de precipitado con 15 ml de agua en ebullición. Este calentamiento tiene por objetivo destruir las enzimas presentes en el tejido, incluyendo las enzimas deshidrogenasa láctica y las nucleotidasas,evitando qe estas últimas degraden la coenzima que es termoestable. continuar la ebullición por 5 min. Enfriar. Como volumen total se ha reducido, agregar agua en cantidad suficiente para completar alrededor de 15 ml.








Materiales y métodos:
Reactivos ( volumen final: 5ml)
[ ]
[] final
Lactato
0,18
0,036
Cianuro
0,08
0,016
Azul metileno
0,02 %
0.04 %
Coenzima
---
0,5...