Metodo de biuret

LABORATORIO BIOQUÍMICA

“Determinación cuantitativa de la concentración proteica de una solución por el método de Biuret”

Objetivo general

Cuantificar proteínas ocupando técnicas espectroscópicas como el método de Biuret.

Resumen

En esta práctica de laboratorio se utilizo un método para la cuantificación de proteínas: método de Biuret, Para lo cual se realizara: una curvaestándar, luego se calculará el coeficiente de extinción y además se realizará la cuantificación de una muestra problema a baja y alta concentración, respectivamente, y se discutirá las ventajas e inconvenientes del método.

Palabras Claves

Cuantificación de proteínas, método de Biuret,

INTRODUCCIÓN

El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otroscompuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida. Basándose en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
El Reactivo de Biuret esta hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6•4H2O). El reactivo, decolor azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. La intensidad de la coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalinonecesario para que tenga lugar.
Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopía ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540 nm (para detectar el ión Cu2+).

Aspectos teóricos de espectrofotometría cuantitativa

La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedadcaracterística de ella, que puede ser utilizada para su identificación y cuantificación.

Todas las sustancias absorben luz en alguna región del espectro electromagnético (VIS, UV, IR, etc.).

La absorción de luz depende de la estructura química del compuesto absorbente, y en especial de ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un compuesto por medio de las característicasde su espectro de absorción.
Ley de Lambert-Beer

Lambert y Beer demostraron que la absorbancia (A), también llamada densidad óptica (D.O.) de una sustancia es directamente proporcional a la concentración (C) de la sustancia absorbente, la longitud del paso de luz ( ) (espesor de la solución) y una constante denominada coeficiente de extinción o coeficiente de absorción ( ), que escaracterístico para cada sustancia a una longitud de onda () determinada.
Ecuación 1

Para medir la absorbancia de una sustancia se utiliza el espectrofotómetro, instrumento destinado a medir la absorción por especies inorgánicas y orgánicas de luz monocromática en la región ultravioleta / visible del espectro.

Análisisespectrofotométrico:

Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia de una sustancia de concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya concentración se conoce y a la cual se denomina solución patrón o estándar.

La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otroscomponentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todas los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las...