Metodos de secuenciamiento
Páginas: 9 (2102 palabras)
Publicado: 25 de mayo de 2011
Universidad de Santiago de Chile
Departamento Ingeniería Informática
Magister en Ingeniería Informática
Tecnologías de Secuenciamiento
Gonzalo Alejandro Berrios Acevedo
Mario Inostroza Ponta
Profesor
Santiago - Chile, 2010
1.- Describa cada una de las tecnologías utilizadas para obtener el genoma humano.
La secuencia completa del genoma humano, correspondiente a 3 billones depares de bases de DNA agrupadas en los 23 pares de cromosomas que posee una célula humana fue liberada a la comunidad mundial en el año 2003 y es considerada como uno de los mayores avances en el área de las ciencias biológicas alcanzado en los últimos 20 años. La iniciativa de obtener la secuencia del genoma humano comenzó a finales de la década de 1990 y nació como un proyecto que involucró alaboratorios de todo el mundo. A poco andar del proyecto, debido a diferencias entre algunos de los participantes, se separó en una iniciativa financiada por fondos públicos (NIH y NSF), y otra apoyada con aportes del sector privado (Celera Genomics). Para realizar esta tremenda proeza ambas iniciativas utilizaron la secuenciación automática de sanger, pero ellas difieren en la estrategia utilizadapara llevar acabo este proyecto.
El proyecto del genoma humano público realizó la creación de “librerias” de clones BAC (vector de clonamiento derivado de un cromosoma artificial bacteriano) correspondientes a fragmentos de DNA para cada cromosoma humano por separado, este proceso se denomina “mapeo físico”. Cada fragmento de DNA (de apróx 100-300 kb) contenido en los BAC son digeridosparcialmente con una enzima de restricción para generar una familia de fragmentos de DNA con un tamaño variable. Estos fragmentos “pequeños” son sometidos a análisis de secuenciación automática por el método de dideoxinucleótido de Sanger ocupando la estrategia de secuenciación denominada “shotgun”. En la figura 1 se presenta un esquema de la primera parte de la técnica en donde una hebra simple de DNAtemplado (letras azules) que será secuenciada aparea con un partidor sintético (letras negras). El partidor es elongado en una mezcla de reacción que contiene los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato normales más una cantidad relativamente baja de uno de los cuatro dideoxirribonucleósidos trifosfato. En este ejemplo, ddGTP acoplado a una molécula fluorescente (amarillo) esta presente en lareacción. Debido a la relativamente baja concentración de ddGTP, la incorporación de una molécula de ddGTP, y por tanto la terminación de la cadena, ocurre sólo en un 1% para una posición concreta en la secuencia. Eventualmente la mezcla de reacción contendrá una mezcla de hebras hijas prematuramente terminadas (truncadas) donde el ddGTP fue incorporado.
Figura 1. Esquema de secuenciación por elmétodo de dideoxinucleótido de Sanger.
La segunda parte de esta técnica se relaciona con la obtención de la secuencia completa del templado de DNA, se realizan cuatro reacciones separadas cada una de ellas con un diferente dideoxinucleótido (ddNTP). El ddNTP que termina cada fragmento truncado puede ser identificado por el uso de las cuatro “tintas” fluorescentes acopladas a cada ddNTP, como indicanlos colores (Figura 2)
Figura 2. Segunda parte del método de Sanger.
La tercera parte comprende el uso del secuenciador automático, en donde las cuatro mezclas de reacción son sometidas a electroforesis capilar y el orden de aparición de cada uno de las cuatro diferentes tintas fluorescentes en el extremo del gel es registrada. El ejemplo muestra el resultado obtenido con el secuenciadorautomático, llamado electroferograma, donde la secuencia original del DNA templado puede ser leída directamente (Figura 3).
Figura 3. Electroferograma obtenido con la máquina de secuenciación automática.
Debido a que la secuenciación del genoma humano se realizó por la estrategia de “shotgun”, es decir, por partes, posteriormente por medio de recursos computacionales, se procedió a...
Departamento Ingeniería Informática
Magister en Ingeniería Informática
Tecnologías de Secuenciamiento
Gonzalo Alejandro Berrios Acevedo
Mario Inostroza Ponta
Profesor
Santiago - Chile, 2010
1.- Describa cada una de las tecnologías utilizadas para obtener el genoma humano.
La secuencia completa del genoma humano, correspondiente a 3 billones depares de bases de DNA agrupadas en los 23 pares de cromosomas que posee una célula humana fue liberada a la comunidad mundial en el año 2003 y es considerada como uno de los mayores avances en el área de las ciencias biológicas alcanzado en los últimos 20 años. La iniciativa de obtener la secuencia del genoma humano comenzó a finales de la década de 1990 y nació como un proyecto que involucró alaboratorios de todo el mundo. A poco andar del proyecto, debido a diferencias entre algunos de los participantes, se separó en una iniciativa financiada por fondos públicos (NIH y NSF), y otra apoyada con aportes del sector privado (Celera Genomics). Para realizar esta tremenda proeza ambas iniciativas utilizaron la secuenciación automática de sanger, pero ellas difieren en la estrategia utilizadapara llevar acabo este proyecto.
El proyecto del genoma humano público realizó la creación de “librerias” de clones BAC (vector de clonamiento derivado de un cromosoma artificial bacteriano) correspondientes a fragmentos de DNA para cada cromosoma humano por separado, este proceso se denomina “mapeo físico”. Cada fragmento de DNA (de apróx 100-300 kb) contenido en los BAC son digeridosparcialmente con una enzima de restricción para generar una familia de fragmentos de DNA con un tamaño variable. Estos fragmentos “pequeños” son sometidos a análisis de secuenciación automática por el método de dideoxinucleótido de Sanger ocupando la estrategia de secuenciación denominada “shotgun”. En la figura 1 se presenta un esquema de la primera parte de la técnica en donde una hebra simple de DNAtemplado (letras azules) que será secuenciada aparea con un partidor sintético (letras negras). El partidor es elongado en una mezcla de reacción que contiene los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato normales más una cantidad relativamente baja de uno de los cuatro dideoxirribonucleósidos trifosfato. En este ejemplo, ddGTP acoplado a una molécula fluorescente (amarillo) esta presente en lareacción. Debido a la relativamente baja concentración de ddGTP, la incorporación de una molécula de ddGTP, y por tanto la terminación de la cadena, ocurre sólo en un 1% para una posición concreta en la secuencia. Eventualmente la mezcla de reacción contendrá una mezcla de hebras hijas prematuramente terminadas (truncadas) donde el ddGTP fue incorporado.
Figura 1. Esquema de secuenciación por elmétodo de dideoxinucleótido de Sanger.
La segunda parte de esta técnica se relaciona con la obtención de la secuencia completa del templado de DNA, se realizan cuatro reacciones separadas cada una de ellas con un diferente dideoxinucleótido (ddNTP). El ddNTP que termina cada fragmento truncado puede ser identificado por el uso de las cuatro “tintas” fluorescentes acopladas a cada ddNTP, como indicanlos colores (Figura 2)
Figura 2. Segunda parte del método de Sanger.
La tercera parte comprende el uso del secuenciador automático, en donde las cuatro mezclas de reacción son sometidas a electroforesis capilar y el orden de aparición de cada uno de las cuatro diferentes tintas fluorescentes en el extremo del gel es registrada. El ejemplo muestra el resultado obtenido con el secuenciadorautomático, llamado electroferograma, donde la secuencia original del DNA templado puede ser leída directamente (Figura 3).
Figura 3. Electroferograma obtenido con la máquina de secuenciación automática.
Debido a que la secuenciación del genoma humano se realizó por la estrategia de “shotgun”, es decir, por partes, posteriormente por medio de recursos computacionales, se procedió a...
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