metodos




Carrera de Biología


Grupo 501


Practica # 3
Tinción de Gram

Presenta:
Erick Pérez Cortes
Flor Itzel Osorio Rodríguez
Shayra Yaritza Islas Arenas
Mayra Hernández de la cruz




Catedrático:
Dra. Consuelo Domínguez Barradas




Tuxpan, ver Agosto 2013


Contenido



INTRODUCCIÓN

La tinción de Gram fuedesarrollada por el doctor Hans Christian Gram en 1884, es hoy la más utilizada en los laboratorios de bacteriología y permite, de acuerdo con la estructura y grosor de la pared bacteriana, agrupar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas. Las Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano y carecen de membrana externa, mientras que las Gram negativas tienen una capa más delgadade peptidoglicano y poseen una membrana externa. Algunas bacterias se clasifican como Gram variables, pues simultáneamente presentan tinción de Gram positivas y de Gram negativas, aún bajo condiciones óptimas de cultivo. (Gamboa. 2005)
Esta tinción puede utilizarse para separar la mayoría de las especies bacterianas en dos grandes grupos, a saber. Consiste, básicamente, en teñir el frotis, fijadoal calor, con un colorante llamado cristal violeta, y después de lavado con agua, tratarlo sucesivamente con una solución de Lugol (yodo más yoduro de potasio), un agente decolorante como el alcohol o una mezcla de alcohol acetona y, por último, con una colorante de contraste como la safranina. Las que captan el colorante básico, cristal violeta (Gram positivas) y por lo tanto se ven de un colorvioleta intenso, y las que pierden ese colorante por lavado con el decolorante alcohol o acetato (Gram negativas) y adquieren un color rojo por la safranina. (Cortes. 2004)
Existen variaciones de esta técnica, pero en términos generales, la tinción de Gram involucra varios pasos:
1. Tinción inicial. Las células se tiñen con cristal violeta, el cual es el colorante primario. En este paso todaslas células se tiñen de morado.

2. Mordente. Se adiciona yoduro (Lugol) que reacciona con el cristal violeta, el cual es el colorante primario. En este paso todas las células se tiñen de morado.

3. Decoloración. Se adiciona un solvente no polar, el cual actúa lavando el complejo cristal violeta-yoduro de las células Gram negativas. De esta manera las bacterias Gram positivas continúanmiradas y las Gram negativas quedan incoloras. Este es el paso critico de esta tinción, pues si se exagera, decolora las Gram positivas y si se hace muy débil no decolora a las Gram negativas.


4. Contratinción. Se vuelven a teñir con safranina o fucsia, de manera que las bacterias Gram negativas, que habían sido decoloradas, se tiñen de rosado a fucsia según el colorante empleado; en tanto, lasbacterias Gram positivas no se afectan con la Contratinción y permanecen moradas debido a lo intenso de la coloración.

Además de una excesiva decoloración, otro factor que puede influir en que las bacterias Gram positivas se observen parcial o completamente rosadas, es la edad del cultivo; las células viejas tienden a perder su capacidad de retener el complejo cristal violeta-yoduro y por lotanto las bacterias se verán rosadas. Otro factor de variabilidad podría ser condiciones de estrés durante el cultivo, que genera formas Gram negativas no viables, dentro de un cultivo de células Gram positivas.
Debe presentarse atención a los lavados que se realizan al ir agregando los diferentes reactivos, si se deja un exceso de agua en la lámina los reactivos se diluirán, especialmente elyoduro. Se han descrito modificaciones de esta técnica orientadas a resolver problemas específicos y cuyas variaciones radican en la composición de los reactivos, especialmente en la empleado como agente decolorante; por lo tanto si se cuenta con varias de estas modificaciones es importante no confundir los reactivos de cada una, pues los resultados pueden ser inadecuados. (Rodríguez Et al. 2005.)...