Microscopía

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Técnicas de microscopía optica

Introducción Durante los últimos años, las técnicas de microscopía óptica y sus aplicaciones h a n experimentado u n auge sin precedentes. Más concretamente, la difusión de sistemas de microscopía confocal d u r a n t e los 90 h a empujado con fuerza el desarrollo de la microscopía de fluorescencia y abierto nuevos horizontes de investigación. Estefenómeno h a venido propiciado por varios motivos. Por u n a parte, los progresos en la tecnología de detectores fotosensibles, tanto chips CCD (charge-coupled devices) como fotomultiplicadores (PMT), cada vez de mayor resolución y sensibilidad. E n segundo lugar, la amplia variedad de fluorocromos disponibles en todo el espectro visible, incluidas las proteínas fluorescentes de medusas (Aquarea Victoria,Renilla, etc) y, m á s recientemente, de corales. Finalmente, la evolución imparable de los sistemas de iluminación, ahora basados en láseres, así como de los elementos ópticos (filtros de interferencia, prismas, rejillas de difracción, etc) cada vez más eficaces. Los recientes progresos de la microelectrónica e informática tampoco h a n quedado desapercibidos en el campo de la microscopía. Elcontrol automatizado de los sistemas de iluminación (barrido por láser, obturadores y diafragmas, ruedas de filtros, etc), de los sistemas de enfoque y posicionamiento, o de los tiempos de exposición y ganancia de los fotodetectores son aspectos que se ejecutan automáticamente desde la consola del ordenador. También es relevante la aportación de la informática en el análisis y procesado de imágenes.La utilización conjunta de la instrumentación más sofisticada junto con avanzados algoritmos de análisis y procesamiento de imágenes permite organizar y dar significado a la información que fluye por el interior del microscopio.

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Todos estos avances h a n resultado determinantes en la evolucióndel microscopio, que h a pasado de ser un instrumento dedicado en exclusiva a la inspección ocular directa, a constituir un elemento más dentro de un sistema complejo que sirve tanto para la observación directa de muestras, como para realizar estudios cuantitativos y comparativos de aspectos más concretos. Entre ellos, podemos destacar la determinación de la localización y concentración demúltiples constituyentes celulares, su trasiego entre distintos compartimentos, su vida media o su interacción con otros componentes. Una de las tendencias más recientes es la observación y análisis de preparaciones biológicas «in vivo», es decir, en u n a situación similar a su estado natural. La posibilidad de generar microentornos compatibles con el mantenimiento normal de la vida (control detemperatura, nutrientes, concentraciones salinas, pH, presión de gases como 0 2 y C 0 2 , etc) permite analizar procesos fisiológicos en distintas escalas temporales. La medida en tiempo real de las variaciones de calcio intracelular en células musculares o el seguimiento de linajes celulares durante el desarrollo de Caenorabditis Elegans son experimentos perfectamente asequibles a día de hoy. En elpresente capítulo, mi objetivo es realizar un repaso personal de las técnicas de microscopía óptica desarrolladas más recientemente, sus fundamentos y sus posibilidades. U n a b r e v e p e r s p e c t i v a histórica Muy frecuentemente, cuando se recuerda o alude al descubridor del microscopio como instrumento científico se menciona sin dudar a Anthony van Leeuwenhoek (Delft, Holanda). Sin embargo,antes de que Leeuwenhoek naciera, u n compatriota suyo —Zacharias Janssen— y el británico Robert Hooke ya habían inventado y construido de forma independiente los primeros microscopios. Estos instrumentos tenían forma de Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723) catalejo invertido y estaban formados por dos lentes: el ocular, que cuyo nombre se relaciona con su proximidad al ojo del observador, y el...