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Biología molecular
Debido a las dificultades tanto de sensibilidad, especificidad y retardo de las técnicas microbiológicas tradicionales, se han desarrollado durante la última década diversas técnicas en el campo de la biología molecular con gran potencial en el área del diagnóstico micológico, tanto para la pesquisa e identificación del agente causal como para la evaluación declonalidad con distintos fines.
Entre las técnicas más difundidas está la amplificación por RPC, especialmente por su alta sensibilidad y rapidez. Esta técnica se ha implementado en diferentes aproximaciones: RPC con partidores especie o género -específicos, RPC y Southern blot, RPC y análisis con enzimas de restricción, RPC anidada, RPC en tiempo real, RPC con análisis de fragmentos ysecuenciación22-24.
En relación a la pesquisa de hongos como agentes causales de infección en diferentes muestras clínicas, los blancos de amplificación más estudiados son el gen para la sub-unidad 18S rRNA y las ITS (internal transcribed spacer) adyacentes, las que forman parte del operón del ARN ribosomal. Éste presenta regiones altamente conservadas, lo que permite la aplicación de RPCpanfúngicos que detectan genéricamente hongos, y también regiones hipervariables en secuencia y/o tamaño, que permiten la identificación de la especie involucrada, ya sea por utilización posterior de sondas, electroforesis capilar para el análisis de fragmentos o secuenciación. Uno de los primeros trabajos que utilizó esta aproximación25 demostró su utilidad en pacientes con episodios de neutropenia yfiebre con sospecha de infección fúngica invasora. La sensibilidad analítica lograda fue de 1 ufc/ml de sangre, detectándose con dos muestras consecutivas de sangre hasta 100% de los pacientes con infección fúngica invasora. La RPC demostró ser el indicador más precoz de infección fúngica, precediendo la evidencia clínica y radiológica, y correlacionándose además con la respuesta a la terapia yevolución clínica. El uso de sondas específicas permitió identificar especie con una correlación de 100% con la identificación microbiológica. Estos hallazgos han sido confirmados por múltiples estudios26, por lo que en nuestro laboratorio se ha iniciado la implementación de estas técnicas (Figura 5). El mayor valor de la RPC es su alto valor predictor negativo, el cual permitiría descartar la presenciade una infección fúngica en forma precoz, disminuyendo el uso empírico de antifúngicos27,28. Sin embargo, estas técnicas se consideran aún en etapa de investigación y no son parte de los criterios de diagnóstico de micosis invasoras comentados previamente. Para su aplicación rutinaria se requiere mejorar aspectos técnicos como son la optimización de los métodos de extracción del ADN fúngico ydisminuir las potenciales contaminaciones con hongos ambientales que puedan entregar falsos positivos. Otro aspecto a considerar es la excesiva sensibilidad de los métodos moleculares, que muchas veces hace difícil la interpretación de un resultado; el hallazgo de ADN fúngico no siempre es sinónimo de infección micótica. Los desafíos en esta área están en la correlación de los métodos propuestos conenfermedad invasora, y por sobre todo el desarrollo de técnicas estandarizadas y reproducibles.

En estudios epidemiológicos de evaluación de clonalidad, se han descrito diversas metodologías para detectar polimorfismos genéticos en levaduras31,32. El análisis con enzimas de restricción fue el primer método utilizado con este fin; sin embargo, el patrón de bandas resulta complejo y difícilde interpretar. La digestión con enzimas de restricción y posterior hibridación con sondas por Southern blot fue un avance importante presentando buena reproducibilidad, pero su laboriosidad y lentitud la hacen una técnica poco aplicable.
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