Practica Bioquimica

BIOQUIMICA
PRACTICA DE LABORATORIO
ESTUDIO CINETICO DE LA ENZIMA ALFA-AMILASA
INTRODUCCION:
La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren. la velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir:
* Por la cantidad de sustrato que desapareceen la unidad de tiempo
* Por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo
En esta practica de laboratorio se comprobara la influencia de la concentración del sustrato (S), del enzima (E), el pH y la temperatura (T) en la cinética del enzima alfa-Amilasa salival en su acción sobre los enlaces alfa 1-4 del almidón. Para ello nos basaremos en la desaparición del almidón en la unidadde tiempo mediante el seguimiento de la reaccion de color que produce el mismo, así como sus productos de hidrólisis con el Yodo en disolución de Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol).
Dado que el almidón esta integrado por dos fracciones, la amilasa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (así como sus respectivos productos de hidrólisis) con el reactivo deLugol.
AMILOSA AMILOPECTINA
Amilasa Salival
AMILODEXTRINAS
(+ IODO color azul violeta)
ERITRODEXTRINAS
(+IODO color rojo pardo)
MALTOSA + GLUCOSA DEXTRINAS LIMITES
(+IODO no dan coloración)
Basándose en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la cinética enzimática la variación de los factores que en ella influyen: c(S), c(E), pH y T, fundamentalmente. Lainfluencia de la c(E), manteniendo constante los demás factores. De forma similar se procede con el estudio de la influencia de la c(S). En el caso del estudio de la influencia del pH y la temperatura se ensayara la actividad del enzima a diferentes valores de ambos con la reaccion del Lugol.

REACTIVOS:
Solucion de la enzima:
* Se prepara colectando 1ml de saliva (previo enjuague de la bocacon agua destilada).
* diluyéndolo hasta 20 ml con agua destilada.

Disolución de Lugol:
* Se prepara disolviendo 1 gr de yodo.
* y 2 gr de Kl en 200 ml de agua destilada.

Disolución Tampón de pH 5.0, 6.8, y 8.0 .
.

MATERIALES:
* Tubos de ensayo.
* placa de porcelana con excavaduras
* vasos de precipitado
* cuba
* cronometro.

EXPERIMENTO1ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE c(E).
PROCEDIMIENTO:

1. Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada uno 2ml de disolución de almidón al 0.5 %.
2. Añada a cada tubo 0.1; 0.2; 0.3 y 0.4 ml de disolución del enzima respectivamente, y complete hasta un volumen de 0.5 ml con agua . Añada primero el agua y luego la disolución del enzima, pues de lo contrario la reacción comenzara a verificarse y usted notendrá en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente después de adicionar la solución del enzima al ultimo tubo ponga en marcha el cronometro y comience a medir el tiempo del experimento.
3. En cada intervalo de 1 minuto ensaye en la placa con excavadura la reaccion de la solucion experimental con el Lugol: para ello solo tiene que extraer con el gotero pequeñas cantidades de cada tubo deensayo en reaccion a una excavadura de la placa y luego adicionar una gota del reactivo de Lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayado.

tubo 1 tubo 3

tubo 2 tubo 4

4. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reaccion alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse del colororiginal del Lugol. Si desea puede adicionar en una excavadura unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solucion de control.
5. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:


TUBOS: | 1 | 2 | 3 | 4 |
Volumen de enzima (ml) | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
Tiempo total de reaccion (min) | 3 | 5 | 6 | 7 |
Velocidad de la reaccion (m1/t) | 0.0333 | .04 | .05 | 0.0571 |

6. Con...