PRACTICAS DE LABORATORIO

OBJETIVO:
Que el alumno aprenda el método colorimétrico de la cianometahemoglobina para la determinación de hemoglobina ya que dicho método es el más empleado por presentar las siguientes ventajas:
1. La cianometahemoglobina es estable en soluciones diluidas.
2. El método mide Hb, Metahb, COHb, No mide SHb.
3. Existen en el mercado estándares certificados de cianometahemoglobina.
4. Las lecturasse pueden hacer en espectrofotómetros de uso común como son el Colema y el Leitz.

FUNDAMENTO:
La sangre se hemoliza por agregado de un agente tenso activo. Con el ferricianuro de potasio se oxida el hierro ferroso de la hemoglobina a férrico para producir metahemoglobina. El cianuro de potasio estabiliza la metahemoglobina como cianometahemoglobina. La coloración producida es directamenteproporcional a la concentración de la hemoglobina presente.

GENERALIDADES:
La hemoglobina (HB) es una proteína globular, qué está presente en altas concentraciones en los glóbulos rojos y se encarga del transporte de O2 del aparato respiratorio hacia los tejidos periféricos; y del transporte de CO2 y protones (H+) de los tejidos periféricos hasta los pulmones para ser excretados.
El examen dehemoglobina es una prueba sanguínea que se ordena con frecuencia y que casi siempre se hace como parte de un conteo sanguíneo completo (CSC)

Los valores normales en la sangre son:
-En el hombre 13.8-17.2g/dl
-En la mujer 12.1-15.1 g/dl
La hemoglobina consta de cuatro unidades de proteína, cada una de ellas con un grupo de hierro-protoporfirina IX (hemo). La secuencia de aminoácidos es la misma en dos delas cuatro unidades de proteína y se designan como cadenas a.
Las dos restantes se llaman cadenas β y son similares, pero no exactamente iguales que las a. La composición tetraurianaria de la hemoglobina tiene una finalidad biológica útil.


MATERIAL/ EQUIPO/ REACTIVOS
-Material necesario para la extracción de sangre
-2 tubos de ensaye de 13x100 con tapón de hule
-Tubo de ensaye de 13 x 75
- 1pipeta graduada de 5 ml
- Una pipeta de Sahli con boquilla
-EDTA al 10%
-Solución de Drabkin
-1 ampolleta de solución estándar (acuglobín)
-Espectrofotómetro con adaptador y 4 celdas

TÉCNICA:
Solución diluyente de Drabkin (cianometa)
Bicarbonato sódico……………1 g
Cianuro potásico……………….0.05g
Ferricianuro potásico………….0.2g
Agua destilada c.b.p……………1,000 ml
1.- Colocar en un tubo de ensayeexactamente 5 ml de solución diluyente de Drabkin.
2.- La muestra de sangre puede tomarse de una punción capilar que fluya libremente o de una vena. En el último caso hay que mezclarla bien. Se traslada exactamente 0.02ml (20 micro litros) de sangre entera con la pipeta de Sahli al tubo de ensayo que contiene el diluyente, enjuagando la pipeta varias veces con el mismo.
3.- Se mezclan la sangre y eldiluyente invirtiendo varias veces el tubo. Se deja en reposo durante 10 minutos para permitir la formación de la cianometahemoglobina, la cual es estable por varias horas.
4.- Se ajusta la escala de longitud de onda del espectrofotómetro a 540 nanómetros (nm).
5.- Se emplea como blanco agua destilada o la solución diluyente. La luz que absorbe el diluyente a 540 nm es insignificante.
6.-El blanco seajusta a 100 en la escala de transmitancia (T) o a 0 en la escala de densidad óptica o absorbancia (D.O o A)
7.- Leer la densidad óptica del problema y calcular la concentración de hemoglobina en la curva de calibración o mediante el factor correspondiente.




CONSTRUCCION DE LA CURVA DE CALIBRACION.
1.- Coloque en una cubeta solución estándar de hemoglobina (Acuglobín), anotando suconcentración.
2.- En una cubeta coloque solución estándar diluida la cual se prepara de la siguiente manera; en un tubo de ensaye se vierten 2.5 ml de acuglobín medidos con exactitud, agregar exactamente el mismo volumen (2.5ml) del diluyente y mezclar perfectamente. Esta dilución del estándar contiene exactamente la mitad de la concentración original.
3.-En una tercera cubeta colocar el blanco (diluyente,...