Presentación pcr y modalidades
Páginas: 6 (1385 palabras)
Publicado: 1 de diciembre de 2011
PCR C
Indice
• • • • • • • • • ¿Qué es l PCR? Q é la Orígenes e historia de la PCR Reactivos necesarios El ciclo de la PCR Optimización del proceso Diseño de cebadores Aplicaciones Variantes de la PCR Análisis de datos de PCR
¿Qué es la PCR?
• L Las siglas PCR provienen d “P l i l i de “Polymerase Ch i Chain Reaction”. (reacción en cadena de la polimerasa). • Es un método para laproducción de un gran numero de copias de un fragmento de ADN a partir de un g pequeño número de fragmentos originales. • T Toma elementos d l proceso d replicación d ADN l del de li ió de ADN. • El proceso podría i t dí interpretarse t fotocopiadora molecular. como una
Una fotocopiadora molecular
Supongamos que el siguiente texto es una secuencia de ADN: “En un lugar de la Mancha de cuyo nombre noquiero acordarme En Mancha, acordarme, no ha mucho tiempo que vivía un hidalgo de los de lanza en astillero, adarga antigua, rocín flaco y galgo corredor. Una olla de g q , p , algo más vaca que carnero, salpicón las más noches, duelos y quebrantos los sábados, lantejas los viernes, algún palomino de añadidura los domingos, consumían las tres partes...” Miguel de Cervantes, 1605 El fragmento deltexto que queremos copiar [en rojo], ha de ser g q q p [ j ], único, de forma que la fotocopiadora (polimerasa) solo copie dicha porción del texto y no otros productos indeseados.
Antecedentes a la PCR
• Southern Blot (1975) permitía una rudimentaria visualización del número de copias de genes en los individuos (RFLPs inserciones y deleciones) (RFLPs, deleciones). • Secuenciación de DNA(1978) requería una previa copia de los genes en plásmidos o vectores. • La construcción de bibliotecas y el escaneo constituía un trabajo de meses que eran exclusivas de cada individuo analizado.
PCR. PCR El descubrimiento
• Ideada por Kary B. p y Mullis en 1983. • Publicada por primera vez en 1985.
Kary B. Mullis fue galardonado con el prémio Nobel de Química en 1993.
¿Invento realmenteMullis la PCR?
• El principio básico de la replicación de un fragmento de DNA ya fue descrito por Gobind Khorana en 1971 1971. • El proceso estaba limitado por la síntesis de los cebadores y los procesos de purificación de la polimerasa. • Mullis desarrolló específicamente el proceso de la copia. copia
Reactivos Necesarios
Solución tampón en la que se p q desarrollará el proceso. Fragmento deADN molde que queramos copiar. 2C b d Cebadores flanqueantes de la fl t d l zona a copiar. Nucleótidos (dNTPs).
ADN polimerasa.
ADN Polimerasa
La copia del molde requiere (separación de las dos hebras). DESNATURALIZACION temperaturas. Polimerasas normales temperaturas. de adn desnaturalización
requiere
altas
son
destruidas
p por
altas
Solución: Es necesaria unapolimerasa que sea estable a altas temperaturas.
Taq polimerasa qp
Propiedades: - No se destruye a 94ºC. - Temperatura optima a 72ºC. Desventajas: - No tiene capacidad autocorrectora. - Tasa de error: 1 base/104
Thermus aquaticus
El Proceso de la PCR
Una PCR consiste en la repetición de 30 a 35 ciclos cada uno de los cuales se divide en las siguientes 3 fases: Desnaturalización: separación delas 2 hebras. Alineación: unión de los cebadores con la hebra desnaturalizada. Polimerización: síntesis de una copia de la hebra original de DNA por la polimerasa.
Temper ratura
100
Desnaturalización Desnaturalización Polimerización
94 oC
Alineación
94 oC
72 oC
50
50 oC
0
Tiempo
¿Cuantas copias?
Es en el tercer ciclo cuando tenemos amplificado nuestro fragmento. ¿Cuantas copias?
En teoría, en cada ciclo se d bl el número d E t í d i l dobla l ú de fragmentos. En la práctica la eficiencia nunca es del 100%. % Con 30 ciclos tendremos teóricamente 109 copias de nuestro fragmento (230) y 60 copias de otros fragmentos fragmentos.
¿Cuantos ciclos?
• Por encima de 35 ciclos el copiado no mejora sustancialmente. • El proceso acaba cuando: – Se agotan los...
Indice
• • • • • • • • • ¿Qué es l PCR? Q é la Orígenes e historia de la PCR Reactivos necesarios El ciclo de la PCR Optimización del proceso Diseño de cebadores Aplicaciones Variantes de la PCR Análisis de datos de PCR
¿Qué es la PCR?
• L Las siglas PCR provienen d “P l i l i de “Polymerase Ch i Chain Reaction”. (reacción en cadena de la polimerasa). • Es un método para laproducción de un gran numero de copias de un fragmento de ADN a partir de un g pequeño número de fragmentos originales. • T Toma elementos d l proceso d replicación d ADN l del de li ió de ADN. • El proceso podría i t dí interpretarse t fotocopiadora molecular. como una
Una fotocopiadora molecular
Supongamos que el siguiente texto es una secuencia de ADN: “En un lugar de la Mancha de cuyo nombre noquiero acordarme En Mancha, acordarme, no ha mucho tiempo que vivía un hidalgo de los de lanza en astillero, adarga antigua, rocín flaco y galgo corredor. Una olla de g q , p , algo más vaca que carnero, salpicón las más noches, duelos y quebrantos los sábados, lantejas los viernes, algún palomino de añadidura los domingos, consumían las tres partes...” Miguel de Cervantes, 1605 El fragmento deltexto que queremos copiar [en rojo], ha de ser g q q p [ j ], único, de forma que la fotocopiadora (polimerasa) solo copie dicha porción del texto y no otros productos indeseados.
Antecedentes a la PCR
• Southern Blot (1975) permitía una rudimentaria visualización del número de copias de genes en los individuos (RFLPs inserciones y deleciones) (RFLPs, deleciones). • Secuenciación de DNA(1978) requería una previa copia de los genes en plásmidos o vectores. • La construcción de bibliotecas y el escaneo constituía un trabajo de meses que eran exclusivas de cada individuo analizado.
PCR. PCR El descubrimiento
• Ideada por Kary B. p y Mullis en 1983. • Publicada por primera vez en 1985.
Kary B. Mullis fue galardonado con el prémio Nobel de Química en 1993.
¿Invento realmenteMullis la PCR?
• El principio básico de la replicación de un fragmento de DNA ya fue descrito por Gobind Khorana en 1971 1971. • El proceso estaba limitado por la síntesis de los cebadores y los procesos de purificación de la polimerasa. • Mullis desarrolló específicamente el proceso de la copia. copia
Reactivos Necesarios
Solución tampón en la que se p q desarrollará el proceso. Fragmento deADN molde que queramos copiar. 2C b d Cebadores flanqueantes de la fl t d l zona a copiar. Nucleótidos (dNTPs).
ADN polimerasa.
ADN Polimerasa
La copia del molde requiere (separación de las dos hebras). DESNATURALIZACION temperaturas. Polimerasas normales temperaturas. de adn desnaturalización
requiere
altas
son
destruidas
p por
altas
Solución: Es necesaria unapolimerasa que sea estable a altas temperaturas.
Taq polimerasa qp
Propiedades: - No se destruye a 94ºC. - Temperatura optima a 72ºC. Desventajas: - No tiene capacidad autocorrectora. - Tasa de error: 1 base/104
Thermus aquaticus
El Proceso de la PCR
Una PCR consiste en la repetición de 30 a 35 ciclos cada uno de los cuales se divide en las siguientes 3 fases: Desnaturalización: separación delas 2 hebras. Alineación: unión de los cebadores con la hebra desnaturalizada. Polimerización: síntesis de una copia de la hebra original de DNA por la polimerasa.
Temper ratura
100
Desnaturalización Desnaturalización Polimerización
94 oC
Alineación
94 oC
72 oC
50
50 oC
0
Tiempo
¿Cuantas copias?
Es en el tercer ciclo cuando tenemos amplificado nuestro fragmento. ¿Cuantas copias?
En teoría, en cada ciclo se d bl el número d E t í d i l dobla l ú de fragmentos. En la práctica la eficiencia nunca es del 100%. % Con 30 ciclos tendremos teóricamente 109 copias de nuestro fragmento (230) y 60 copias de otros fragmentos fragmentos.
¿Cuantos ciclos?
• Por encima de 35 ciclos el copiado no mejora sustancialmente. • El proceso acaba cuando: – Se agotan los...
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