proteinas

Ejemplo de un Trabajo práctico para la
determinación cuantitativa de proteínas(1)
Objetivos.
Al término de la práctica el alumno ha de ser capaz de:
1. Conocer los principales métodos de valoración de las proteínas.
2. Recordar las leyes básicas de absorción de luz para la determinación
cuantitativa de compuestos coloreados.
3.

Definir los componentes de un
comprender el manejo delmismo.

espectrofotómetro

que permita

4. Construir una recta de calibración con una solución de albúmina de suero
bovino como proteína patrón para cada una de los métodos
colorimétricos del Biuret y de Lowry.
5. Establecer el desarrollo de los métodos determinando la linealidad, la
sensibilidad, el límite de detección y el rango de cada uno de los métodos
ensayados.

1. ¿Cuáles son losmétodos más usuales de valoración de las
proteínas?
Existen diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de
proteína presente en las muestras biológicas, basados en las propiedades que
muestran las proteínas en solución.
Los métodos más usuales son:
- Reacción del Biuret.
- Método de Lowry.
- Método de Bradford.
- Método del ácido Bicincónico.
- Absorción en elultravioleta.
- Métodos inmunológicos.

1

Este apunte fue tomado como ejemplo de la Universidad de Madrid, Facultad de Química página web: (http://www.um.es/bbmbi/).

En la práctica se van a ensayar los dos primeros métodos colorimétricos de
Biuret y Lowry.

¿En qué consiste la reacción del Biuret?

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la
condensación de dosmoléculas de urea con eliminación de amoníaco.

H 2N

CO

NH 2

H 2N

CO

NH 2

Q

CO

H 2N

NH CO NH 2

Biuret

Urea

Reacción del Biuret
Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una
solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces
peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta unmáximo de absorción a 540 nm.
Las características más importantes de la reacción son:
· La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los
péptidos y proteínas.
· Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml.
· No depende de la composición de aminoácidos.
· Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.
O

C

C

NH
RC H
O

C
NH
RC H

O

HNCu2+

H CR
C

O

HN
H CR

Violeta-púrpura
Complejo proteína-Cu(II)

¿Cuál es el fundamento del método de Lowry?

Para aumentar la sensibilidad de la reacción del biuret, el complejo proteínaCu2+ se hace reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteus, dando una
coloración azul, con un máximo de absorción a 650 nm. Esta coloración se
atribuye a la reducción del ácidofosfomolíbdico/fosfotúngstico a azul de
heteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de los residuos
tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las
proteínas que forman el complejo con el Cu2+.
Las características del método son:
· La intensidad de la coloración varía con la composición de aminoácidos
de la proteína.
· Es más sensible que el ensayo del biuret. Elrango es de 0,1-1 mg/ml.
· La modificación de Hartree incrementa la sensibilidad de 0,015-0,15
mg/ml.
· Presenta muchas interferencias.

Complejo
Proteína-Cu 2+
AA red.

Complejo
Proteína-Cu 2+
AA oxid.

Reactivo Folin
oxid.
AMARILLO

Reactivo Folin
red.
AZUL

Esquema de la reacción de Lowry

¿Qué características poseen otros métodos de valoración de proteínas?

Método deBradford:
· Consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración
azul entre los residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el
colorante Azul Coomassie.
· Absorbe luz a 595 nm.
· El rango de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y
de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estándar).

· La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos
básicos y...