Protocolo De Citogenetica

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| | CITOGENÉTICA |
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Sección Genética Evolutiva. Facultad de Ciencias. Montevideo, UruguayDrs. Francisco Panzera & Ruben Pérez1.- MATERIAL DE ESTUDIOS CROMOSOMICOSMaterial: Gónadas de machos y hembras, de individuos adultos. Solo excepcionalmente pueden ser utilizados ninfas de quinto estadio.Extracción del material: Debe ser realizada solamente sobre individuos vivos.No sirven ejemplares muertos.Fijación del material: Las gónadas, una vez extraídas, deben ser sumergidas inmediatamente en un líquido fijador, denominado 3: 1, el cual debe ser preparado en el momento. Este líquido fijador está compuesto por etanol absoluto (3 partes) y ácido acético glacial (una parte). A la hora de fijación y a las 24 horas se debe cambiar el fijador por otro preparado en elmomento. Este material, debidamente identificado con el número del individuo, se guarda en un refrigerador a -20º C, o en su defecto en heladera 4º C.2.- ENVIO DEL MATERIAL POR CORREOSe realiza en los frascos de fijación, debidamente sellados herméticamente a temperatura ambiente.3.- TÉCNICAS CITOGENÉTICASA.- Tinción con orceína acético-láctica mediante el método de aplastadoEn primer lugar selimpian los portaobjetos en una mezcla de 30 ml de agua destilada +10 ml del etanol + 10 ml de ácido acético. Se dejan así unos minutos y después se limpian con toallas sanitarias o pañuelos de papel que no dejen residuos ni fibras.Para preparar la orceína acético-láctica se disuelven 2 gramos de orceína sintética (Sigma 07380) en 100 ml de una solución compuesta por 45 ml de ácido láctico y 55 ml deácido acético glacial ppa. Se calienta hasta la primera ebullición y se deja reposar durante 24 horas. Luego se filtra quedando lista para usarse. Esta orceína se debe almacenar a temperatura ambiente, en un frasco ámbar o protegido de la luz con aluminio.Para realizar la tinción se saca el material previamente fijado en 3:1 y almacenado a -20º C. La primera etapa es la de limpieza de tráqueas queperjudican la obtención de un buen aplastado. Para lo cual se coloca en un vidrio de reloj, parte de la gónada en 3:1. Se procede a la extracción de las tráqueas y de aquellas estructuras que no correspondan a las gónadas, tales como parte del tubo digestivo o glándulas anexas. Una vez realizada la limpieza, los trozos seleccionados de las gónadas se colocan en un vidrio de reloj con ácido acéticoal 50% (preparado en el momento) por no mas de 2 a 3 minutos. El material se ablanda (macera) de esta manera y se disgrega con dos pinzas sobre un portaobjetos previamente identificado con el número del individuo analizado. De manera de facilitar esto último, dicha disgregación se realiza sobre una superficie obscura (puede ser una revista con cubierta negra o cartón negro) y se le ponen encima 2 o3 gotas de orceína. Se debe tener la precaución de que en ningún momento el material quede seco. Luego se le coloca encima un cubreobjetos dejándolo caer desde una posición de 45º, cuidando de que el material quede en el centro del cubreobjeto. En el caso de que quedaran burbujas de aire se deben sacar mediante suaves golpes con un lápiz de grafo. La preparación se deja con el colorante de 2 a 3horas.Posteriormente se procede a la dispersión (extendido) del material con un lápiz de grafo, golpeando el cubreobjeto de forma vertical y concéntrica, desde el centro hacia afuera. Se debe evitar todo desplazamiento lateral del cubreobjeto pues ello provocará que las células se rompan.Luego se procede al aplastado propiamente dicho, para lo cual se coloca una toalla de papel sobre elcubreobjetos, inmovilizando desde una esquina y con el dedo pulgar se realiza una fuerte presión sobre varios lugares del portaobjetos. Es muy importante que dicha presión se realice de forma vertical, evitando que se mueva lateralmente el cubreobjetos. Para aplastar se recarga el dedo pulgar de forma vertical con todo el cuerpo por 3 o 4 veces. Se inmoviliza sobre otra esquina y se vuelve a hacer el...