Protocolo de extraccion
Páginas: 2 (432 palabras)
Publicado: 3 de junio de 2011
Extracción RNA: Método CTAB con modificaciones
Preparación CTAB (1L):
NaCl 116,88 g Agregar en este orden
PVP (2%) 20g a la solución
Tris (100 nM) 12,114 g + 1ml de DEPC (1%DEPC)EDTA (25 nM) 9,3 gr dejar disolver ON
CTAB (2%) 20g con agitación constante
1. Pulverizar 8 grs del tejido congelado por medio de N2 líquido en mortero para luego depositar encompartimento metálico con bolones con espátula, vaciar N2 líquido y esperar a que deje de burbujear y se cierra, colocar en el molino con las tapas hacia afuera, asegurar.
Se deja en el molino por 1minuto, a los 30 segundos se para, se golpea contra el mesón y se abre y si le falta molido, se agrega más N2 líquido y se repite el proceso cuantas veces sea necesario.
2. Agregar material al tubo depolipropileno de 50ml con 15ml de buffer de extracción a 65°C. Agregar b-Mercapto etanol al buffer (2%), luego se agita.
3. Se incuba por 15 min, cada 5 min se agita (tipo inmersión), si quedantrozos se usa el Turrax, limpiandolo previamente con agua destilada y solución RNasa, se utiliza a 4 rpm. Se incuba por otros 15 min a 65°C.
Se agregan 15 ml de espermidina a tubo ependorf
4.Agregar 1 volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (IAA) 24:1
5. Centrifugar a 10.000 rpm por 25 min a 4°C. Rescatar sobrenadante (SN) y agregar a tubos estériles.
6. Agregar SN volumen igual decloroformo: IAA (24:1) y centrifugar a 10.000 rpm por 25 min a 4° C.
7. Rescatar SN y agregar 1/4 de volumen de 10 M LiCl.
8. Incubar ON a 4°C.
9. Centrifugar a 12.000 rpm por 20 min a 4°C,eliminar SN.
10. Secar los tubos rápidamente sobre papel absorbente y lavar el pellet con 70% etanol, dejar secar al aire por 5 min.
11. Disolver el pellet en 400 ml de H2O DEPC.
12.Precipitar agregando 1/10 volumen de 3M acetato de sodio pH 5,5 y 2,5 volúmenes de etanol 70% e incubar 3 horas a -80°C.
13. Centrifugar a 12000 rpm por 30 min. Lavar el pellet con 70% etanol...
Preparación CTAB (1L):
NaCl 116,88 g Agregar en este orden
PVP (2%) 20g a la solución
Tris (100 nM) 12,114 g + 1ml de DEPC (1%DEPC)EDTA (25 nM) 9,3 gr dejar disolver ON
CTAB (2%) 20g con agitación constante
1. Pulverizar 8 grs del tejido congelado por medio de N2 líquido en mortero para luego depositar encompartimento metálico con bolones con espátula, vaciar N2 líquido y esperar a que deje de burbujear y se cierra, colocar en el molino con las tapas hacia afuera, asegurar.
Se deja en el molino por 1minuto, a los 30 segundos se para, se golpea contra el mesón y se abre y si le falta molido, se agrega más N2 líquido y se repite el proceso cuantas veces sea necesario.
2. Agregar material al tubo depolipropileno de 50ml con 15ml de buffer de extracción a 65°C. Agregar b-Mercapto etanol al buffer (2%), luego se agita.
3. Se incuba por 15 min, cada 5 min se agita (tipo inmersión), si quedantrozos se usa el Turrax, limpiandolo previamente con agua destilada y solución RNasa, se utiliza a 4 rpm. Se incuba por otros 15 min a 65°C.
Se agregan 15 ml de espermidina a tubo ependorf
4.Agregar 1 volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (IAA) 24:1
5. Centrifugar a 10.000 rpm por 25 min a 4°C. Rescatar sobrenadante (SN) y agregar a tubos estériles.
6. Agregar SN volumen igual decloroformo: IAA (24:1) y centrifugar a 10.000 rpm por 25 min a 4° C.
7. Rescatar SN y agregar 1/4 de volumen de 10 M LiCl.
8. Incubar ON a 4°C.
9. Centrifugar a 12.000 rpm por 20 min a 4°C,eliminar SN.
10. Secar los tubos rápidamente sobre papel absorbente y lavar el pellet con 70% etanol, dejar secar al aire por 5 min.
11. Disolver el pellet en 400 ml de H2O DEPC.
12.Precipitar agregando 1/10 volumen de 3M acetato de sodio pH 5,5 y 2,5 volúmenes de etanol 70% e incubar 3 horas a -80°C.
13. Centrifugar a 12000 rpm por 30 min. Lavar el pellet con 70% etanol...
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