Protocolo rna protect bacteria

Lisis enzimática
* Antes de comenzar: Si se utiliza el Kit de RNAeasy para purificación de ARN, añadir 10µl de Betamercaptoretanol por un 1 ml de buffer RLT y mezclar.

1. Preparar bufferTE (30mM de TRIS- Cl, 1 mM de EDTA a pH 8.0) conteniendo 15 mg/ml de lisozima.
2. Colocar el volumen necesario de cultivo de baterías (1 volumen). Pipetear 2 volúmenes de RNA protect BacteriaReagent en un tubo, después mezclar en vortex por 5 segundos, incubar a 15-25 °C (tabla 1).
3. Centrifugar por 3 minutos 6,250 rpm.
4. Decantar sobrenadante (si es necesario invertirlo sobre unaservilleta)
5. Añadir proteinasa K al volumen apropiado de buffer TE con lizosima (tabla1), añadir mezcla al pelet y resuspenderlo con pipeteo.
6. Mezclar en vortex por 10 segundos. Incubar a15-25 °C por 10 minutos en un shaker, o ponerlo en vortex cada 2 minutos.
7. Añadir el volumen apropiado de etanol y mezclar por pipeteo (tabla 1).

Protocolo de Purificación de RNA Total delas bacterias lisadas.
* Antes de empezar: El buffer PRE se proporciona como un concentrado, añadir 4 volúmenes de etanol absoluto.

1. Transferir 700µl de lisado, incluyendo cualquierprecipitado que se pudo haber formado a una columna RNAeasy mini spin colocada en un tubo de recolección de 2 ml (viene en el Kit). Centrifugar por 15 segundos a 10,000 rpm, descartar el filtrado.
a.El uso de DNAsas en la purificación puede afectar en la cantidad de RNA purificado por mini columna.
2. Añadir 700µl a la columna RNAeasy mini spin y centrifugar por 15 segundo a 10,000rpm paralavar la membrana de la columna, descartar el filtrado y el tubo de recolección.
3. Colocar la mini columna en un nuevo tubo de recolección de 2ml, añadir 500µl de buffer RPE, centrifugar por 15segundos a 10,000 rpm para lavar la membrana de la columna, descartar el filtrado. Reutilizar el tubo de recolección.
4. Añadir 500 µl de RPE a la columna y centrifugar por 2 minutos a 10,000...