Quimico

CAPÍTULO 12

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real
Josep Costa
Servicio de Microbiología. Hospital Clínic i Provincial. Barcelona. España.
Hoy en día, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza normalmente en la rutina asistencial de la mayoría de nuestros laboratorios, pero su empleo se ha limitado, con pocas excepciones, al campo de la virología y en especiala un reducido grupo de virus con gran interés económico, para los que se dispone de ensayos comerciales bien estandarizados. Por diversas razones, la PCR convencional se ha implementado poco en el diagnóstico de otras muchas enfermedades infecciosas a pesar de aportar indudables ventajas. La PCR a tiempo real combinada con los nuevos sistemas automáticos para la purificación de ácidos nucleicos,ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares para la identificación y cuantificación de los agentes infecciosos de interés clínico. Debido a sus indudables ventajas, como la facilidad de empleo, la mayor rapidez o el menor riesgo de contaminación, la PCR a tiempo real, irá reemplazando la PCR convencional y se extenderá a un amplio abanico deaplicaciones microbiológicas. Palabras clave: PCR a tiempo real. Diagnóstico molecular. Sondas fluorogénicas.
Enferm Infecc Microbiol Clin 2004;22(5):299-305

La PCR convencional en el contexto de la microbiología clínica
El proceso de detección de un agente infeccioso por amplificación genética se desarrolla de manera habitual en tres etapas. La primera consiste en la extracción y purificación de losácidos nucleicos del microorganismo de la muestra biológica, seguido de la amplificación de un segmento seleccionado del genoma del microorganismo mediante reacción en cadena de la polimerasa, es decir, la PCR propiamente dicha. Finalmente, en la tercera etapa se lleva a cabo la detección de los fragmentos amplificados en la PCR (amplicones) por electroforesis en gel de agarosa y tinción conbromuro de etidio, o mediante hibridación con sondas específicas. En general todo este proceso suele durar aproximadamente 24 h. En el ámbito de la microbiología clínica, la PCR se ha aplicado en tres grandes campos: 1. Diagnóstico etiológico. La PCR es sobre todo útil en ausencia de métodos de diagnóstico alternativos o cuando éstos son muy complejos, para mejorar la eficacia diagnóstica complementandométodos convencionales o si se requiere un diagnóstico rápido y precoz del agente etiológico para poder iniciar el tratamiento específico lo antes posible. 2. Control del tratamiento con antimicrobianos. La PCR se utiliza tanto para la selección de los pacientes que deben ser tratados como para, una vez iniciado el tratamiento, comprobar su eficacia, siendo importante para ello disponer demétodos cuantitativos. 3. Caracterización genética de agentes infecciosos Ge. notipificación; identificación de mutaciones determinantes de resistencias a fármacos o de virulencia; epidemiología molecular; etc. En los últimos 10 años se han desarrollado innumerables aplicaciones de la PCR en microbiología clínica. No obstante, desde el punto de vista asistencial, la PCR sólo se ha consolidado como unprocedimiento realmente útil en virología, al ser una buena alternativa al aislamiento por cultivo celular. Salvo algunas excepciones, la introducción de la PCR en la rutina asistencial en otros campos de la microbiología clínica ha sido muy limitada y su aplicación se ha restringido a aquellos microorganismos que no crecen o crecen mal en los medios de cultivo convencionales y aún en ese grupo, laimplementación real de esta metodología ha sido muy escasa. En términos generales, puede decirse que la aplicación de la PCR en el laboratorio de microbiología asistencial se ha restringido a un pequeño grupo de agentes infecciosos con gran interés económico para las empresas de diagnóstico microbiológico, como por ejemplo virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), de la hepatitis C (VHC), de...