químca

FUNDAMENTOS DE LA
TÉCNICA PCR

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PCR ¿Qué es?

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Técnica que nos permite amplificar selectivamente un
segmento específico de DNA, hasta obtener una
cantidad suficiente para su posterior manipulación

FOTOCOPIADORA MOLECULAR
FORMA DE CLONACIÓN “ IN VITRO”

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¿Cuáles son los fundamentos?
EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNApolimerasa realiza la extensión
del primer utilizando la cadena complementaria como molde
DNA Polimerasa
5’

3’
dNTPs

5’

dTTP
dATP
dGTP
dCTP

+

Mg

++

3’

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EXTENSION DEL CEBADOR
Utilizando dos cebadores que son complementarios a los
extremos 3’ del fragmento de DNA de doble cadena que
queremos amplificar

3’

5’

DNA polimerasa

DNA Polimerasa
3’

5’

7¿Qué necesitamos?

DNA molde
Tampón de la reacción
(tris,BSA, K…)

Cebadores

Nucleotidos
(dNTPs, A, C, G y T)

DNA polimerasa
Mg++

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ELECCIÓN DE PRIMERS
Programas de ordenador
. Primer express
•PrimerGen searches strings of amino acid residues in order to reverse-translate
oligonucletide primers of a desired range of lengths and maximum number of degeneracies.
•Primer(Stanford) Sun Sparcstations only
•Primer (Whitehead) Unix, Vms (and DOS and Mac if you can compile it)
•Amplify, Bill Engels (Macintosh only), is for use in designing, analyzing, and simulating
experiments involving the polymerase chainreaction (PCR). You can obtain your copy of
Amplify here
•PrimerDesign 1.04, a DOS-program to choose primer for PCR or oligonucleotide probes.
See also thePrimerDesign Welcome Page.
•PC-Rare, a new software by R. Griffais, which uses a rare octamer at the 3' termini of the
primer. This powerful (but user friendly) software is available for Macintosh and Windows
environment.
•Primer Design, a Java applet by Luca Ida Giovanni TOLDO.
•CODEHOP, PCR primers designed from protein multiple sequence alignments (Local
mirror site at WIS).
•Primer3, anonline service to pick PCR primers from nucleotide sequence. (Local mirror
site at WIS).
.NetPrimer (PREMIER Biosoft International). NetPrimer combines the latest primer design
algorithms with a web-based interface allowing the user to analyze primers over the internet

- Evitar G y C en el extremo 3’

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DNA polimerasas
Termolábiles: Tª óptima de actuación de 42ºC
- DNA polimerasa I de E.Coli
- Fragmento Klenow de DNA polimerasa
- T4 DNA polimerasa
Termoestables: Tª óptima de actuación de 72-74ºC
- Taq DNA polimerasa
- Tth polimerasa

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Taq DNA Polimerasa es la polimerasa de elección

(no tienen actividad 3’-5’ exonucleásica)

PARA AUMENTAR LA FIDELIDAD
No aumentar mucho
los ciclos

No añadir cantidades
excesivas de Cl2Mg
Igual cantidad para los
cuatro dNTPsy en la
Disminuir el tiempo
mínima concentración
de cada ciclo
posible

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Buffer de la reacción
La composición puede ser distinta según las casa
comerciales.
- ClK
- Tris-ClH
- Gelatina
- DMSO
- Detergentes: tritón...
- BSA
- PEG

Cloruro de Magnesio (MgCl2)
Su concentración resulta fundamental para la
optimización de la reacción

Contribuye a aumentar la temperatura dehibridación

[Mg] disminuyen la especificidad
[Mg] aumentan la especificidad

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COMPONENTE
H2O esteril

VOLUMEN

CONCENTRACION
FINAL

20,7μL

Buffer PCR 10x

2,5μL

dNTPs mix
(25mM de cada uno)

0.2μL

1X
200μM (cada uno)

Primer mix
0,4μL
(25 pmoles/μL de cada primer)

0,4μM (cada primer)

Taq DNA polimerasa

0,2μL

1U/25μL

DNA (100ng/μL)

1,0 μL100ng/25μL

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“n CICLOS”: ciclo 4

“n CICLOS”: ciclo 5

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La cantidad de DNA dobla teóricamente con
cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la
cantidad de DNA es dos veces la del ciclo
anterior.

Después de:
- 2 ciclos tenemos 2 x 2
- 3 ciclos - 2 x 2 x 2
- 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2
Así, después de ciclos de N ciclos
tendremos 2N.
Pero la reacción...