Reacciones luminosas de la fotosíntesis

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AMADEO SENA 2º BIOTECNOLOGIA

PRACTICA 1 BIOQUÍMICA. REACCIONES LUMINOSAS DE LA FOTOSÍNTESIS

OBJETIVOS

1) Aislar cloroplastos para estudiar la reacción fotosintética de un colorante, 2,6-
diclorofenol-indofenol por parte de los cloroplastos
2) Observar el efecto de la longitud de onda sobre la capacidad reductora de los
cloroplastos
3) Estudiar el efecto de unherbicida y un detergente sobre la capacidad reductora de los
Cloroplastos

MATERIALES Y REACTIVOS

-Hojas de acelga
-Tijeras
-Colorímetro
-Cubetas de colorímetro de 1ml
Mortero de porcelana
-Embudo de vidrio
Erlen Meyer
Muselina para filtrar
Bombillas de 100W
Tubos eppendorf de colores
Pipetas de 1, 5 y 10 ml
Tampón de homogeneización. Para 250 ml de tampón 0.7 g de Na2HPO4, 1.6g de Na2HPO4, 27.5 g de sacarosa, y 1.03 g de KCl
Reactivo 2,6-diclorofenol-indofenol (2,6-DCPIP) 0.025% p/V en agua
Herbicida Glifosato (Round-up, de la casa comercial Monsanto) 3% (v/v) en H20
Tritón X-100 al 0.1% (v/v) en H2O

MÉTODOS

Para aislar los cloroplastos, se lava una hoja de acelga con agua y se trocea con unas tijeras. En un mortero de porcelana se tritura 1g de trozos deacelga durante 5 minutos. Luego se añade al mortero 12 ml de tampón de homogenización frío. Posteriormente se utiliza un embudo de vidrio, en el que se añade en su interior una doble capa de muselina previamente mojada con tampón, para filtrar el extracto.

Para saber cual será la cantidad de cloroplastos más adecuada para realizar los objetivos del experimento, se prepara 6 tubos cada uno con unrespectivo volumen de cloroplastos y de tampón de homogeneización.

| Volumen (µl) |
Tubos | Suspensión cloroplastos | Tampón homogeneización |
1 | 0.0 | 900 |
2 | 50 | 850 |
3 | 100 | 800 |
4 | 150 | 750 |
5 | 200 | 700 |
6 | 250 | 650 |

A cada tubo anterior se añade 200 µl del reactivo 2,6-DCPIP. Se remueven bien los tubos para que se mezcle la suspensión y se colocan lostubos en un porta cubetas delante de una lámpara con una bombilla de 100 W de potencia, y a una distancia de 25 cm.

Se mide con un temporizador el tiempo en minutos que tarda en desaparecer el color azul del reactivo que se transforma en la coloración verde inicial, en cada tubo.

Para estudiar el efecto de diferentes longitudes de onda de luz visible en el rendimiento fotosintético, se utilizan1 tubo de color verde, 1 tubo de color rojo, un tubo transparente y un tubo envuelto con papel de aluminio, que simula la condición de oscuridad.

De los 6 tubos anteriores se escoge el que haya cambiado a color verde su contenido, entre el minuto 15 al minuto 20. La concentración de cloroplastos de ese tubo será la cantidad adecuada de suspensión de cloroplastos.

En un vaso de precipitadose añade 5 ml de tampón homogenizador y la concentración adecuada de cloroplastos, se mezcla bien y se mete 1 ml de esta solución en una cubeta de colorímetro. La cubeta se inserta en el colorímetro y este se ajusta a cero a 652 nm.

En los 4 tubos a estudiar, se añade 200 µl de 2,6-DCPIP se mezcla bien y se lee la absorbancia a 652 nm. Esto nos dará la absorbancia a tiempo 0.

Después, en eleppendorf envuelto en papel de aluminio se añade 1 ml de la muestra. A los 30 segundos colocamos un 1 ml de la muestra en el tubo transparente y lo situamos frente a la bombilla. Cada 30 segundos se hace lo mismo con los tubos restantes, correspondientes a luz verde y roja.

1.5 minutos después de meter el tubo 4 a la luz, leemos la absorbancia a 652 nm del tubo que representa la oscuridad,vertiéndolo en una cubeta de colorímetro. Inmediatamente se retorna la muesta al tubo oscuridad.

A intervalos de 30 segundos se lee el valor de absorbancia a 652 nm de los 3 tubos restantes, este proceso se repite a los 6, 9, 12, 15 y 18 minutos.

Para conocer el efecto de un herbicida y un detergente sobre la capacidad reductora de los cloroplastos., se preparan 3 tubos eppendorf transparentes...
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