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Departamento de Ciencias Biológicas

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS (SDS-PAGE)
Laboratorios N° 13 y 14:

INTRODUCCIÓN

La electroforesis es una técnica que se basa en la migración de moléculas proteicas cargadas en un campo eléctrico. Es muy utilizada en análisis bioquímicos, ya que permite visualizar y separar proteínas en tiempos relativamente cortos, pudiendo estimar la cantidad deellas en una muestra, el grado de pureza de una preparación, o bien, para determinar algunas propiedades importantes como son su punto isoeléctrico o su peso molecular.
Esta técnica se realiza generalmente en geles preparados con un polímero entrecruzado de poliacrilamida, teniendo varios componentes esenciales para que se pueda llevar a cabo una eficiente separación, ellos son la acrilamida:quien forma el polímero del gel, bisacrilamida: el agente entrecruzador, y TEMED con APS (persulfato de amonio) quienes inician la polimerización. De esta forma, el gel actúa como un “colador” molecular, haciendo más lenta la migración de aquellas proteínas con un mayor tamaño molecular. En una electroforesis existen dos tipos diferentes de geles: el concentrador y el separador, en donde cada unocumple una función distinta. En el gel concentrador es en donde se aplica la muestra, en él las proteínas se concentran antes de entrar en el gel separador. En éste último se produce la migración diferencial de las proteínas de acuerdo a su tamaño.
Existen muchas variables de la electroforesis, una de ellas es con la utilización de SDS (dodecil-sulfato de sodio), y se usa principalmente para estimarla pureza y peso molecular de las proteínas. El SDS es una sustancia anfipática, un detergente con gran poder denaturante que se une con firmeza a la mayoría de las proteínas por interacciones hidrofóbicas y en cantidad proporcional a su peso molecular. La gran carga negativa que otorga a las proteínas enmascara a las cargas propias de las moléculas proteicas, por lo que existe una directarelación carga-masa. Es por ello que al trabar con SDS se logran separar macromoléculas casi exclusivamente en base al orden de sus masas moleculares por los efectos de filtración en el gel y el campo eléctrico proporcionado. [1]
Luego de que las proteínas hayan corrido, se pueden visualizar las bandas incubando el gel en azul de Coomasie R-250, un colorante que se une a las proteínas pero no al gel.Y posteriormente lavándolas con una solución desteñidora.

Objetivos: Realizar una separación electroforética en presencia de SDS, logrando ver las bandas obtenidas para determinar el peso molecular de una banda desconocida mediante la interpolación del gráfico de logaritmo de los pesos moleculares estándares versus la migración.

MATERIALES Y MÉTODOS

* Acrilamida/bisacrilamida (37:1)* Tris-HCl 1,5M pH 8,8
* Tris-HCl 0,5M pH 6,8
* SDS 10%
* APS 10%
* TEMED
* Buffer tris-glicina
* Azul de Coomasie R-250
* Guantes
* Micropipetas P1000, P50, P20 (Accuebiotech)
* Agua destilada
* Tubos eppendorf
* Cámara de electroforesis (Miniprotean- 3-cell, Biorad)

Preparación de geles y armado de geles

Ambos geles fueron preparados entubos de reacción, agregando reactivos según las cantidades que se explicitan en la tabla N°1, pero procurando agregar el TEMED sólo unos segundos antes de que la mezcla sea vertida entre los vidrios del soporte.

GEL SEPARADOR | GEL CONCENTRADOR |
REACTIVOS | VOLUMEN | REACTIVOS | VOLUMEN |
Acrilamida/Bisacrilamida(37:1) | 2 mL | Acrilamida/Bisacrilamida(37:1) | 510 uL |
Tris-HCl 1,5MpH 8,8 | 1,25 mL | Tris-HCl 0,5M pH 6,8 | 375 uL |
APS 10% | 50 uL | APS 10% | 30 uL |
SDS 10% | 50 uL | SDS 10% | 30 uL |
Agua destilada | 1,65 mL | Agua destilada | 2,04 mL |
TEMED | 2,5 uL | TEMED | 3 uL |
Tabla N°1: Volúmenes de reactivos agregados para preparar cada uno de los geles.

Una vez mezclados los reactivos del gel separador, éste se agregó suavemente entre los vidrios...