técnica de separación de proteínas por SDS-PAGE.

Laboratorio N° 2. Proteómica: técnica de separación de proteínas por SDS-PAGE.
Introducción.
El fin del siglo XX ha visto una explosión de información proveniente de los seres vivos, especialmente en biología molecular esto debido a la secuenciación de genomas, obtención de secuencia y estructura de proteínas y los estudios sobre la expresión simultánea de muchos genes bajo muchas condicionesdiferentes. Con respecto a la secuenciación de genomas, uno de los proyectos más ambiciosos ha sido sin duda el Proyecto Genoma Humano, elaborado para caracterizar todo el material genético humano. El objetivo final de este proyecto, iniciado en 1991, fue descubrir y mapear cada uno de los aproximadamente 35.000 genes humanos y hacerlos accesibles para estudios biológicos futuros. Con ladisponibilidad pública de esta información y como una forma de complementar datos obtenidos por otras técnicas nace la proteómica. La información que se obtiene desde la proteómica, la genómica y la metabolómica se enmarca en lo que se conoce actualmente como la era post-genómica (1). La proteómica se define como la caracterización a gran escala de las proteínas de una línea celular, tejido u organismo,utilizando diversas técnicas y recursos bioinformáticos. Es así como se requiere de técnicas de separación (electroforesis monodimensional, electroforesis bidimensional de alta resolución y/o cromatografía líquida multidimensional), técnicas de identificación de proteínas (digestión de proteínas y espectrometría de masas o en su defecto secuenciación por el método de EDMAN), bases de datos yherramientas bioinformáticas. Por ejemplo, la información que se obtiene a partir de las secuencias de las proteínas es relevante en el área de la salud humana puesto que nos permite comprender cómo se comporta el cuerpo humano en respuesta a una enfermedad (2).
La electroforesis monodimensional es una electroforesis en gel la que se destaca por ser uno de los métodos más potentes para separarproteínas. La separación se basa en la filtración en gel y en la movilidad electroforética de la proteína a separar. Las proteínas de mayor masa molecular son retardadas en presencia de un gel. Comúnmente, este gel es una matriz de poliacrilamida, en donde el gel proviene de la polimerización de los sustratos poliacrilamida y N, N´-metilenbisacrilamida (PAGE del inglés; polyacrilamide gelelectrophoresis). Para aumentar la resolución de las proteínas, se han diseñado dos tipos de geles uno concentrador el cual contiene un amortiguador de pH acido el cual permite que la mezcla de proteínas entre alineada al gel resolutivo. La función de este gel es permitir la resolución de las proteínas a un pH más básico. Una variante a este tipo de electroforesis involucra la adición del detergente sodio dodecilsulfato (SDS) al gel, al amortiguador de corrida y al amortiguador de carga. El SDS se une a la mayoría de las proteínas, desnaturandola y otorgándole una carga negativa, lo que produce que la separación sea en base a la masa molecular. Para visualizar las bandas de proteínas se adiciona el colorante azul de coomassie el que es capaz de fijarse a las proteínas y no al gel. Alternativamente, esposible usar la tinción con nitrato de plata (3).
Materiales.
Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 (amortiguador para el gel concentrador), Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 (amortiguador para el gel resolutivo), Glicerol, -mercaptoetanol, Azul de bromofenol, EDTA, SDS, Azul de Coomassie R-250, persulfato de amonio, TEMED, Metanol, acido acético, Azul de Coomassie G-250, glicina, solución de acrilamida/bisacrilamida,papel whatman, HCl, cámaras de electroforesis y fuente de poder, muestras problema, baño calefactor.

Procedimiento experimental.
1. Elaboración del gel resolutivo y concentrador.
Primero usted debe preparar el gel resolutivo, para ello agregue los siguientes reactivos en el mismo orden en que se muestran en la tabla (USE GUANTES):
Reactivo
Volumen
H2O
1.7 mL
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8...