Tecnica ema

¿QUÉ ES TÉCNICA EMA?

EMA: Acrónimo de bromuro de etidio monoazida
Técnica que distingue células vivas de células muertas con el pre-tratamiento de muestras con bromuro de etidio monoazida para la prevención de la amplificación del ADN de células muertas durante qPCR.
 
El nuevo método es una variación de la técnica qPCR, esta técnica genera cantidades grandes de ADN a partir demuestras diminutas, pudiendo ser empleado para detectar cantidades muy pequeñas de patógenos. Sin embargo qPCR copia solamente el ADN designado y no indica si el ADN procede de una célula que estaba muerta o viva, información necesaria a la hora de evaluar muestras por la presencia de microorganismos que puedan provocar enfermedades.
 
El bromuro de etidio monoazida (EMA) es una sustanciaquímica que se une covalentemente al ADN en las células muertas y no puede salir posteriormente. El EMA se inserta solamente en el ADN de las membranas de células dañadas de bacterias muertas.
Después del tratamiento de la bacteria con EMA, se radian las muestras con luz visible de alta intensidad. Esto hace que el EMA se una fuertemente al ADN de las células muertas en las que se insertó. Las unionesimpiden a las moléculas de ADN separarse, por lo que no pueden ser copiados durante el PCR. Sólo el ADN de células vivas se podría copiar, alertando de este modo a los realizadores del test de la presencia de bacterias vivas.
Una vez determinadas las concentraciones óptimas de EMA se puede inhibir completamente la amplificación de ADN de células muertas.

¿CÚANDO SE EMPLEA LA TÉCNICA EMA?El análisis del ADN total puede conducir a una sobreestimación sustancial de la presencia de microorganismos vivos y amenazas patógenas. La falta de diferenciación entre el ADN de las células bacterianas viables y muertas es por lo tanto un obstáculo importante para una amplia gama de aplicaciones de diagnóstico molecular basado en ADN. Por eso se utiliza en análisis que requieren muchaconfiabilidad como en la búsqueda de patógenos en alimentos, análisis clínicos y agua potable así como en verificación de esterilidad de fármacos; estos son estudios que además exigen rapidez de resultados y reducción de costos.
Podemos mencionar algunos ejemplos de su uso en:
* Detección de Salmonella viable en huevo y pollo.
* Detección de patógenos alimentarios(Salmonella,E.coli,L.monocytogenes…) en embutidos
* Detección de Zygosaccharomyces bailii viable en jugos de fruta

¿CÓMO FUNCIONA LA TÉCNICA EMA?
La técnica se efectúa al igual que una PCR de tiempo real (qPCR), que es una variante de la PCR convencional utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Para ello emplea,una mezcla de reacción que contiene: un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa degeneración de uno o más productos específicos. Ese fluoróforo agregado en el buffer de reacción es por lo general SYBR-Green y en este caso además se adiciona al buffer de reacción el bromuro de etidio monoazida
El bromuro de etidio monoazida se utiliza en combinación con PCR de tiempo real para inhibir la amplificación de ADN de células muertas. Al añadir EMA a la muestra de ensayo que contienelas células viables y muertas, penetra en las células muertas con la pared celular comprometida y se une al ADN. Ya en el termociclador se expone a la luz durante 1 min, lo que conduce a la unión covalente con ADN y a la inactivación de EMA libre. EMA no puede entrar en las células viables, en consecuencia hay dos poblaciones de ADN después de la purificación. La población de ADN de células...