Tinción Inmunocitoquímica

Tinción
INMUNOCITOQUÍMICA


La inmunocitoquímica es una técnica para la localización de moléculas en los tejidos mediante el empleo de anticuerpos (proteínas del tipo inmunoglobulina G). Es una técnica que gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la estandarización de su protocolo se ha convertido en un método sencillo, rápido y muy potente. Se basa en la gran especificidad y altaafinidad que tienen los anticuerpos para reconocer a moléculas y unirse a ellas. Además, la conjugación o combinación de los anticuerpos con enzimas o con sustancias fluorescentes permite detectar cantidades ínfimas de moléculas presentes en el tejido.
Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las técnicas inmunocitoquímicas son del tipo G, producidas por unas células del sistemainmunitario denominados linfocitos B. La producción masiva de anticuerpos se produce en un animal cuando le inyectamos una molécula que reconoce como extraña, es decir, nuestra molécula problema. Estos anticuerpos pasan al suero sanguíneo que se extrae del animal inmunizado y a partir del cual se purifican los anticuerpos producidos, los cuales se usarán posteriormente en la técnica inmunocitoquímica. Lasmoléculas complejas como la proteínas tienen en su estructura varios determinantes antigénicos, es decir, lugares que son capaces de desencadenar una respuesta inmune. Ello implica que cada determinante antigénico activará un clon, grupo de de linfocitos B, que producirá anticuerpos contra él. Los anticuerpos de todos los clones de linfocitos B activados por la molécula inyectada irán a parar alsuero. Cuando se emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoquímica se dice que se están empleando anticuerpos policlonales. Existe una técnica que perimite aislar y cultivar en el laboratorio (in vitro) de forma inividualizada a cada uno de los clones activados durante la respuesta inmune. Cada uno de esos cultivos producirá un tipo de inmunoglobulina G que reconocerá sólo a uno de losdeterminantes antigénicos de la molécula inyectada. A estos anticuerpos se les denomina monoclonales ya que proceden de linfocitos que producen inmunoglobulinas idénticas.

Esquema resumido de las diferencias en la obtención de anticuerpos policlonales (izquierda) y monoclonales (centro y derecha).
Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse en dos dominos: la fracción cristalizable y lavariable. El dominio variable es el que se encarga de reconocer al determinante antigénico de nuestra molécula. Hay dos sitios de unión por lo que cada inmunoglubulina podría reconocer a dos moléculas o determinantes antigénicos, que han de ser iguales y estar muy próximos entre sí. La fracción cristalizable tiene una estructura similar para todas las inmunoglubulinas G producidas por los individuosde una misma especie.
Para que un anticuerpo se una a su determinante antigénico localizado en una molécula, ésta no debe alterarse. De otro modo ese determinante antigénico no será reconocido por el anticuerpo. Por ello el proceso de fijación del tejido debe elegirse para preservar al máximo a la molécula que queremos detectar. Por ello se usan diferentes fijadores según el tipo de molécula enla que estemos interados. También es necesario considerar el método de obtención de los cortes. Inclusiones en parafina pueden dañar las moléculas por lo que en la mayoría de los casos se suele trabajar con cortes de vibratomo o con secciones obtenidas por congelación.
Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la molécula que queramos detectar, no son visibles con el microscopio por lo que latendremos que conjugar (unirla) a otras moléculas que nos den una señal visible. Estas moléculas que aportan visibilidad a los anticuerpos suelen ser de dos tipos: moléculas fluorescentes y enzimas. Las primeras se pueden observar con el microscopio de fluorescencia mientras que las segundas pueden convertir determinados sustratos solubles en productos insolubles y coloreados. La señal aparece allí...